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酶定向進(jìn)化的“加速器”—基于CFPS的高通量篩選方案（一）
酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因編輯及干細(xì)胞技術(shù)、靶向藥物的生產(chǎn)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物制備等領(lǐng)域都有著重要的作用。由于溫度、pH、溶劑穩(wěn)定性以及底物特異性和活性的限制，天然酶通常不是工業(yè)生產(chǎn)的較佳選擇，定向進(jìn)化是改善酶催化活性和熱穩(wěn)定性的常用方法。
基于細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的突變體蛋白篩選流程包括構(gòu)建突變基因庫、構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、擴(kuò)大培養(yǎng)、裂解、純化和活性測(cè)試等流程，操作繁瑣、周期長(zhǎng)、人力成本高昂。如果目的突變蛋白對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用，還可能導(dǎo)致表達(dá)失敗。突變體蛋白篩選需要更高效的高通量篩選方案。
無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）是一種沒有活細(xì)胞參與的體外蛋白質(zhì)生物合成技術(shù)，在高通量篩選場(chǎng)景具有優(yōu)勢(shì)：
①CFPS操作簡(jiǎn)單，可搭配高通量移液工作站，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。
②CFPS是開放的反應(yīng)體系，可以根據(jù)特定蛋白質(zhì)的調(diào)整pH、溫度等反應(yīng)條件，且允許在反應(yīng)后上清液中直接檢測(cè)突變蛋白功能，無需純化。
③CFPS不受宿主細(xì)胞活力的限制，允許生產(chǎn)細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)。
④CFPS允許使用PCR產(chǎn)物作為模板，極大縮短模板制備流程。
PLD高通量篩選案例
本文展示了珀羅汀生物基于自主研發(fā)的CFPS系統(tǒng)建立的高通量酶篩選方案：
通過簡(jiǎn)并引物引入突變，建立突變文庫，利用菌落分離單個(gè)突變基因，經(jīng)過菌落PCR獲得線性模板，線性模板直接用于CFPS反應(yīng)，數(shù)小時(shí)后獲得突變體酶，直接取上清檢測(cè)酶活性。
利用該方案，我們?cè)?span style="color: rgb(255, 76, 0);">三天內(nèi)完成了96個(gè)phi29 DNA聚合酶突變體的表達(dá)，并對(duì)其活性進(jìn)行了檢測(cè)，找到了較為高效的phi29 DNA聚合酶突變體。
突變引入及環(huán)化
我們選取了phi29DNA聚合酶的第221位和第350位氨基酸作為突變位點(diǎn)。先利用PCR的方式，將突變通過引物引入片段；再通過重疊PCR的方式整合突變片段。將整合好的目的基因片段和線性化的環(huán)狀片段通過seamless酶進(jìn)行連接，形成環(huán)化質(zhì)粒。
在此過程中，每次以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR之后，使用Dpn I 酶37℃消化1h以去除原始模板。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并涂板
取5μL引入突變的質(zhì)粒，加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，置于冰上30min。隨后將上述感受態(tài)細(xì)胞置于42°C水浴中，熱激90秒后迅速放回冰浴中，靜置3~5min；再將其加入到500 μL不含抗生素的SOC或LB培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37°C震蕩培養(yǎng)1h。通過離心菌液（5000 rpm，1min）沉淀菌體，再將大部分培養(yǎng)液移除，剩余約50~100μL的培養(yǎng)液后重懸菌體，最后，全部均勻涂布到含卡那霉素的LB平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
挑取單克隆并保菌
向96孔板中加入100μL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，然后從LB培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的搖床中180rpm震蕩培養(yǎng)1h。
菌體PCR及高通量蛋白表達(dá)
從震蕩培養(yǎng)1h的96孔板的每個(gè)孔中取出1μL培養(yǎng)基，作為模板加入PCR體系。在經(jīng)過適當(dāng)?shù)腜CR程序后，取5μL PCR反應(yīng)體系，作為模板加入無細(xì)胞表達(dá)體系。表達(dá)4個(gè)小時(shí)后，即可在體系中產(chǎn)生目的蛋白酶——phi29 DNA 聚合酶。
活性測(cè)定
Phi29 DNA聚合酶的活性測(cè)定是利用聚合酶活性來擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因的線性模板，通過最終產(chǎn)物綠色熒光的強(qiáng)度對(duì)phi29 DNA聚合酶的活性做出判斷。首先從最終的無細(xì)胞反應(yīng)體系中直接取出1μL的反應(yīng)上清液作為酶溶液加入到擴(kuò)增體系，該體系含有使phi29起效的緩沖液、綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒模板以及擴(kuò)增所需的引物。然后在42℃的條件下擴(kuò)增2h生成線性模板。最后取5μL的線性模板加入到終體積為50μL的無細(xì)胞反應(yīng)體系中，6小時(shí)后測(cè)定其熒光值，找出活性較強(qiáng)的phi29 DNA聚合酶突變體。
活性結(jié)果
在激發(fā)波長(zhǎng)485nm發(fā)射波長(zhǎng)535nm的條件下，測(cè)定綠色熒光蛋白的熒光值。不同孔中的熒光值有明顯的不同，表明不同phi29 DNA聚合酶的突變體有不同的活性強(qiáng)度。
突變測(cè)序
測(cè)定活性之后，從之前保存的96孔培養(yǎng)板上取活性強(qiáng)度較高的幾個(gè)孔位所對(duì)應(yīng)的菌體，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序操作。我們成功找到了在此板上活性強(qiáng)度前三位的phi29 DNA聚合酶突變體。其在221位和350位的氨基酸組合如下所示。
總結(jié)
通過上述實(shí)驗(yàn)，我們展示了一種基于珀羅汀無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的高通量篩選、驗(yàn)證突變體酶的方案。該方案在3天內(nèi)完成了近百種突變蛋白的構(gòu)建表達(dá)及活性驗(yàn)證，顯著縮短了蛋白篩選的時(shí)間，減少了人工操作成本，可極大提高研發(fā)效率。
除了本文展示的方案，珀羅汀生物還建立了一種通過引物引入突變，并直接通過PCR獲得線性模板的高通量篩選方案，并利用該方案在一天內(nèi)完成了近百種GFP突變體的篩選。具體方案將在后續(xù)文章展示，敬請(qǐng)期待！
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