本文要點：使用短波紅外（SWIR）（1000-2000 nm）分子染料進(jìn)行體內(nèi)生物成像相比于可見光和近紅外-I（NIR-I，700-900 nm）染料，能夠?qū)崿F(xiàn)更深的穿透和更高的對比度。開發(fā)新的SWIR分子仍然相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性。本研究開發(fā)了SRHCYs，一組基于半花菁的熒光染料，其吸收（830-1144 nm）和發(fā)射（886-1217 nm）波長可調(diào)。通過增強(qiáng)供體部分和延長多亞甲基鏈，這些染料的光物理屬性得到了精確調(diào)整。SRHCY-3，具有可點擊的疊氮基團(tuán)，被選用于活體小鼠血管的高性能成像，實現(xiàn)了腦和肺癌的精確檢測。這些探針的組合實現(xiàn)了體內(nèi)多色成像，幾乎沒有光學(xué)串?dāng)_。該報告展示了一系列具有良好光譜特性的SWIR半花菁染料，用于高對比度生物成像和多重檢測。

活體成像

在這項研究中，通過分子工程設(shè)計、合成和評估了一系列名為SRHCYs的新型半菁染料，在 SWIR 窗口中具有可調(diào)的吸光度 （830-1144 nm） 和發(fā)射 （886-1217 nm） 光譜。應(yīng)用供體增強(qiáng)和聚甲辛鏈延伸兩種策略來實現(xiàn)分子光學(xué)性質(zhì)的高效調(diào)控，并建立了結(jié)構(gòu)-光物理關(guān)系。此外，在對小鼠血液/腫瘤血管和淋巴管系統(tǒng)進(jìn)行 SWIR 成像后，優(yōu)化的體內(nèi)循環(huán)速率能夠在活體小鼠中進(jìn)行癌癥成像。SRHCY還具有集成可調(diào)諧 SWIR 吸收和發(fā)射特性的優(yōu)勢，因此可以選擇適用的熒光團(tuán)來匹配可用于體內(nèi)SWIR多色成像的可用激光器和濾光片組。

在NIR-I 研究領(lǐng)域中，通過在堿存在下加熱氯取代花青染料（如 IR-783）的溶液來生成半菁染料。將花青染料 FD-1080 轉(zhuǎn)化生產(chǎn) SWIR 半菁染料。通過增強(qiáng)供體并延長聚甲辛鏈以紅移吸收/發(fā)射波長，并引入了疊氮基團(tuán)來功能化探針。

圖1. SRHCY 探針的設(shè)計概念

作者測試了探針的光物理性質(zhì)。如圖2b、d所示，SRHCY1-4在CH2Cl2中的吸收/發(fā)射波長分別為830/886、928/1002、1036/1103和1144/1217 nm。在醛末端的二甲基氨基反應(yīng)后，成功產(chǎn)生了典型的“推拉”結(jié)構(gòu)，通過增加共軛雙鍵的數(shù)量，有效地減少了占據(jù)分子軌道未占據(jù)分子軌道能隙，從而將吸收和發(fā)射轉(zhuǎn)移到SWIR窗口（圖2c）。當(dāng)共軛鏈增加一個共軛雙鍵時，在吸收和發(fā)射波長上都觀察到約100nm的紅移。延伸共軛雙鍵的策略也可以在另一個花青分子的聚乙炔家族中實現(xiàn)約100nm的紅移，這表明調(diào)節(jié)共軛雙鍵的數(shù)量對于含聚乙炔分子的波長調(diào)節(jié)是非常有效的。由于染料的多樣性，能夠以平衡的SWIR波長和亮度篩選分子，SRHCY-3被選為體內(nèi)生物成像。

圖3. Balb/c 裸鼠背部全身血管的體內(nèi)實時成像

對于體內(nèi)應(yīng)用，通過將PEG鏈摻入SRHCY-3中，以獲得水溶性染料SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm，QY=0.04%）。與SRHCY-3（Em=1103 nm）相比，SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm）的發(fā)射波長藍(lán)移了23 nm，表明聚乙二醇化對分子核心的波長影響最小如圖3所示，在靜脈注射后，對麻醉的Balb/c裸小鼠進(jìn)行了曝光時間（ET）為500 ms的視頻速率成像，捕捉了背側(cè)、側(cè)面和腹側(cè)視圖。所有圖像都顯示了高空間分辨率、低背景和清晰的血管，這歸因于1300 nm以上組織吸收、散射和自發(fā)熒光的減少。肺部是顯現(xiàn)的器官，其次是腎臟，它們在10秒內(nèi)被清晰地分辨出來，并在逐漸消退之前達(dá)到熒光強(qiáng)度?？蓪崟r檢測整個身體的高密度血管網(wǎng)絡(luò)并具有高信噪比，精確地描述了探針在小鼠血液中移動時的行為。SRHCY-3-PEG2000能夠有效地穿透小鼠腹部的皮膚，并在注射后不久在腹側(cè)視圖中清楚地描繪出小腸和結(jié)腸部分，證明了SRHCY-3-PEG2000的高性能SWIR體內(nèi)成像能力。藍(lán)色虛線上的熒光強(qiáng)度分布顯示，染料突出顯示的血管非常清晰，由于SWIR激發(fā)和明亮的SWIR發(fā)射，峰之間明顯不同。還計算了圖像中峰值的半峰全寬（FWHM）（圖3d-f）。血管結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確可視化對于實時跟蹤血液循環(huán)系統(tǒng)至關(guān)重要，SRHCY化合物的高性能SWIR成像結(jié)果可能為未來探索血管功能障礙開辟新的可能性。

圖4. 使用SRHCY-3-PEG2000膠束（100μL，5mg/kg，根據(jù)染料濃度計算）在攜帶A549的腫瘤小鼠中腫瘤血管的代表性時間過程圖像

將SRHCY-3-PEG2000加載到膠束上（Em = 1079 nm，QY = 0.28%），是使 SWIR 分子水溶性并提高其亮度。如圖4a所示，收集1300 nm 以上的高對比度腫瘤血管圖像，研究尾靜脈注射后腫瘤血管內(nèi)分子循環(huán)的整個過程。首先觀察到腫瘤的主要血管及其無序的傳入血管分支。然后，致密的毛細(xì)血管變得清晰可見，而較大血管的熒光信號減弱甚至消失。證實了SRHCY-3-PEG2000膠束的高度豐富和精細(xì)的腫瘤血管成像能力。然后，還計算主要血管和毛細(xì)血管的 FWHM 值，并在圖4 b/c 中標(biāo)記。這些觀察結(jié)果表明，納米級SRHCY-3-PEG2000膠束可以為檢測 SWIR 窗口中的微觀細(xì)節(jié)提供顯著的對比度。同時SRHCY-3-PEG2000的成像遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過ICG（使用ICG幾乎看不到毛細(xì)血管）。定量 SNR 分析表明SRHCY-3-PEG2000具有更高的 SNR 值。所有數(shù)據(jù)都證明了作者新設(shè)計的分子具有的光學(xué)特性。

圖5. 將SRHCY-3-PEG2000（約10μL，5 mM）注入兩只后足墊，對正常Balb/c裸鼠進(jìn)行淋巴結(jié)的背側(cè)SWIR熒光成像，曝光時間為 500 ms

為了進(jìn)一步驗證高亮度成像劑在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)勢，在裸鼠身上進(jìn)行了淋巴管和淋巴結(jié)的成像。如圖5a所示，在俯臥裸小鼠中，將熒光團(tuán)皮下注射到兩個腳墊中后，左/右腘LN和左/右骶LN被超高清標(biāo)記。SRHCY-3-PEG2000也在尾部底部附近皮內(nèi)注射，如圖5c所示。注射后，高信噪比染料清晰地顯示了仰臥位小鼠的淋巴管和淋巴結(jié)（圖5b），這主要證明了染料在臨床上尋找LN的潛在用途。臨床試驗使用ICG作為示蹤劑，尋找外科切除和預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的前哨LN。（59）臨床醫(yī)生實際上在腫瘤附近注射ICG，以觀察引流腫瘤的淋巴管以及前哨淋巴結(jié)。將SRHCY-3-PEG5000或ICG皮內(nèi)注射到攜帶A549腫瘤小鼠尾部附近。如圖5d和S24-S25所示，注射后不久，SRHCY-3-PEG5000顯示從大腿內(nèi)側(cè)的淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管引流到腹股溝LN，腹股溝LN可以逐漸顯現(xiàn)。大約1小時后，腹股溝淋巴結(jié)和腫瘤之間的淋巴管變得明顯。然而，12小時后，淋巴管可能由于肝臟攝取信號重疊而消失。同時，從注射后6-24小時開始，腫瘤熒光從部分明亮轉(zhuǎn)變?yōu)槊髁?，腫瘤與肌肉的比率（TMR）增加到約3.2。至于ICG（圖5e和S26–S27），淋巴管和腹股溝LN有明顯的標(biāo)記，但觀察到的腫瘤熒光信號很小。此外，非常高的信號集中在肝臟和腸道，這與之前文獻(xiàn)中報道的ICG的已知肝臟清除率和低腫瘤攝取率是一致的。收集淋巴管系統(tǒng)的橫截面強(qiáng)度分布顯示，SRHCY-3-PEG5000的淋巴特征明顯更清晰（半峰全寬約為441μm），與ICG在1200 nm LP濾光片下分析給定血管時觀察到的更彌漫的特征（半峰寬值為713和1623μm）形成鮮明對比（圖5f）。這一結(jié)果表明，在較長波長下工作的分子，如SRHCY-3，可以比NIR-I染料獲得更高的清晰度。

最初用PEG2000修飾SRHCY-3染料以實現(xiàn)水溶性，之后將PEG長度從PEG2000延長到PEG5000以改善腫瘤攝取。評估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的體內(nèi)代謝特征和排泄途徑。在Balb/c裸鼠腹部注射后的不同時間點記錄SWIR熒光成像。在ICR小鼠腹部注射后，以多個時間間隔捕獲SWIR熒光圖像。給藥后6小時，SRHCY-3-PEG5000的肝臟攝取量下降了37.5%，而SRHCY-3-1PEG2000僅下降了25.3%。此外，在6小時的時間過程中，SRHCY-3-PEG5000在膀胱中的相對SWIR熒光強(qiáng)度保持在約2的值，而SRHCY-3-1PEG2000在1小時后沒有顯示出可檢測到的膀胱攝取。在24小時和48小時收集了排泄的尿液或糞便，SWIR半定量熒光分析表明，當(dāng)PEG的聚合度增加時，肝臟信號減少，膀胱信號增加。最后，通過兩種方法評估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的生物相容性：細(xì)胞毒性研究和小鼠重要器官的H&E染色。最初，細(xì)胞毒性試驗顯示，即使在高達(dá)2 mM的樣品濃度下，兩種探針在24小時的孵育期后對細(xì)胞也沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。這表明它們具有低毒性和良好的體外細(xì)胞生物相容性。此外，包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟在內(nèi)的各種器官的H&E病理切片表明，這些器官沒有明顯的損傷或病變。因此，探針在體內(nèi)應(yīng)用中是安全且生物相容的。

圖7. SRHCY-1-PEG2000（100μM）、SRHCY-2-PEG2000（10μM）和SRHCY-4膠束（10μM）描繪雙色和三色成像

如上所述，SRHCY是具有高吸收系數(shù)、分離良好的吸光度和高效SWIR發(fā)光的生物偶聯(lián)探針；這些有價值的特性活體小鼠體內(nèi)探測和區(qū)分多種成分或靶點的需要（圖7a）。探索了使用探針進(jìn)行多路成像的可行性。

首先，通過瘤內(nèi)注射將SRHCY-1-PEG2000給予攜帶A549的腫瘤小鼠，以精確定位腫瘤部位。隨后靜脈注射SRHCY-4膠束（圖7b）。注射后，立即使用660或1064 nm激發(fā)激光結(jié)合各種LP濾光片進(jìn)行SWIR雙色成像，這允許同時成像和區(qū)分腫瘤和腹部血管。如圖7d，青色通道清晰地標(biāo)記了全身血管、肺、肝，甚至腹部皮膚下的腸腸系膜血管和腸壁血管，質(zhì)量很高。品紅色通道僅顯示腫瘤輪廓，表明良好的光譜分離。隨后，放大腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)血管包裹著腫瘤組織，血管信號與腫瘤信號明顯分離，不受任何干擾（圖7e）。評估了三個通道的光譜串?dāng)_：660 nm激光用于SRHCY-1-PEG2000通過口服給藥追蹤腸道，808 nm激光用于NRHCY-2-PEG2000追蹤LN，1064 nm激光用于MRHCY-4膠束照亮腹部血管（圖7c）。疊加后，如圖7f所示，發(fā)現(xiàn)這三種顏色表現(xiàn)出相互分離和不干涉的特性，這表明SRHCY是一種非常好的多色成像組合。

隨著SWIR成像在學(xué)術(shù)和臨床研究中繼續(xù)蓬勃發(fā)展，鑒于SWIR區(qū)域更明顯的優(yōu)勢，追求更長波長將是一種日益增長的趨勢。在這項工作中，按照結(jié)構(gòu)裁剪的指導(dǎo)方針，在SWIR窗口中描述了一系列光譜上不同的半花菁染料，并證明了增強(qiáng)供體和多烯鏈伸長是將D-π-a特征半花菁化合物的吸收/發(fā)射從NIR-I窗口推到SWIR窗口的有效策略。這些實際的化學(xué)經(jīng)驗可以指導(dǎo)或應(yīng)用于其他分子骨架，以發(fā)現(xiàn)新的高級SWIR熒光團(tuán)。其中，SRHCY-3被篩選并應(yīng)用于被動成像檢測的血管系統(tǒng)、淋巴結(jié)/血管系統(tǒng)、腫瘤血管生成和皮下或原位腫瘤的成像。最重要的是，SRHCY的組合為在活體小鼠中進(jìn)行多色成像提供了一種可行的方法。成像參數(shù)和造影劑設(shè)計的進(jìn)一步優(yōu)化可能會在未來帶來更好的應(yīng)用。此外，大多數(shù)長波長SWIR分子仍然受到肝臟高攝取的影響；開發(fā)可快速從體內(nèi)排泄且代謝降解很少的腎透明光學(xué)試劑可能是解決這一問題的有效方法。