一、概述

類器官污染是一個老生常談的事情，尤其是做胃腸道，組織本身帶來的菌群數(shù)量非常龐大，一旦消毒不到位，就會導致類器官培養(yǎng)失敗。上一期我們學習了類器官污染鑒別與除菌攻略（一），接下來小愛帶大家了解類器官原代培養(yǎng)無菌預防及細胞房除菌方案（二）。

二、原代培養(yǎng)無菌預防

1、預防無菌各個環(huán)節(jié)

2、取樣及保存無菌預防

注意無菌性：

1）為預防污染，可在組織保存液(abs9784)中加入1%雙抗(abs9244)；

2）組織保存液體積要能浸沒整個組織，一般5-10mL；

3）取樣瓶要保證無菌，也可以用15mL或50mL無菌離心管當取樣管；

4）用酒精棉消毒過的鑷子將組織放入含有組織保存液的取樣瓶中；

5）手術切除的組織需立即轉入含有組織保存液無菌取樣瓶中。

保存及運輸條件：

1）4℃保存，冰袋運輸；

2）越早做，成功率越高，當天做最佳，最晚不超過48h。

3、原代培養(yǎng)試劑抗生素添加指南

備注：

三抗：青霉素10kU/mL，鏈霉素10mg/mL，兩性霉素B25µg/mL。工作濃度稀釋100X：青霉素100U/mL，鏈霉素100ug/mL，兩性霉素B 0.25µg/mL。

慶大：10mg/mL。工作濃度200X—20000X：0.5ug/ml-50ug/mL

4、細胞房著裝要求

操作細胞培養(yǎng)物前后應洗手。穿戴個人防護設備不僅可保護您免受危險品污染，還可降低皮屑以及衣服上污物和灰塵污染培養(yǎng)物的可能。

正確的穿衣順序：

1）換專用鞋

2）無塵手套（避免不潔的雙手經(jīng)穿著時沾附于無塵衣上）

3）網(wǎng)帽（帶網(wǎng)帽時須確保頭發(fā)不可暴露于網(wǎng)帽外，之后戴口罩遮住口鼻）

4）無塵服（不要穿棉質衣服(脫落纖維)

5）鞋套

5、超凈臺試劑布局

適合慣用右手的工作人員的工作臺基本布局。慣用左手的工作人員可相應地調(diào)整工作臺面上物品的擺放位置(圖源網(wǎng)絡)

超凈工作臺或安全柜里的物品擺放一般遵循以下右手試用習慣，并可根據(jù)特殊實驗中增加物品進行相應的改動。

1）在工作臺中部開闊區(qū)域放置細胞培養(yǎng)容器；

2）移液器置于右前方易于取用的地方；

3）試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取；

4）試管架置于中后部，用于固定其他試劑；

5）小型容器置于左后部，用于盛放廢液。

6、人為操作技巧

1）小心取用無菌實驗物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝下放置桌面。

2）每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同也不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以75%酒精擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10min以上后，再進行下一個細胞株之操作。

3）離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標記筆標示內(nèi)容物名稱、操作日期、操作人員姓名。若是細胞傳代培養(yǎng)，更需注明目前的代數(shù)，以及這是同一代中的第幾盤。

三、細胞房除菌方案

細胞房主要做好清潔和消毒工作，小愛匯總了目前細胞房常用的消毒試劑種類及作用原理，供大家了解。

除菌劑種類及作用原理

1、儀器設備、物體表面除菌方案

適宜微生物增殖的主要條件是溫暖潮濕的地方，比如培養(yǎng)箱、水盤、水浴鍋等，常用的除菌劑如下所示：

培養(yǎng)箱除菌劑(abs9372-480mL)

培養(yǎng)箱除菌劑特點：

廣譜高效：專門用于清除CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)的細菌、真菌及支原體等微生物污染；

安全性高：無刺激，無腐蝕，不揮發(fā)；

使用方便：直接噴灑即可，省時省力。

用法：

1、移除細胞后，直接對細胞培養(yǎng)箱的隔板、內(nèi)壁噴灑適量，也可倒出少許，將脫脂棉球浸泡后擦拭使用；

2、建議一周處理一次，配合培養(yǎng)箱水盤除菌劑使用效果更佳。遇污染爆發(fā)時期，如梅雨季節(jié)等，可適當增加用量。

細胞房除菌劑(abs9373-480mL)

細胞房除菌劑特點：

具有很強的抑菌功能，可用于細胞房的污染控制，通過清除細胞房內(nèi)細菌、真菌及其孢子，可有效防止細胞的污染，從而減少由于細胞污染帶來的人力、財力、時間方面的浪費。

用法：

1．直接對細胞房的死角、墻面、空間進行噴灑，也可倒出少許，將脫脂棉球浸泡后擦拭使用。 建議一周處理一次，配合紫外線使用效果更佳。
2．建議每立方米(m3)使用量為5-8mL，如10m²、高3m的房間推薦用量為150mL。遇污染爆發(fā)時期，如梅雨季節(jié)等，可適當增加用量。若室內(nèi)墻壁上有霉菌生長，可噴灑于墻壁表面，或者用浸泡后的棉球擦拭。

水盤抑菌劑(abs9374-20mL)

水盤抑菌劑特點：

用來消毒培養(yǎng)箱中的水盤，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無毒；對不銹鋼無腐蝕性；不揮發(fā)。

用法：

1）建議每周進行一次系統(tǒng)地清潔和消毒培養(yǎng)箱水盤。

2）稀釋100倍即可使用，即將1升水中加入10mL的水盤抑菌劑。

水浴鍋抑菌劑(abs9371-100mL)

水浴鍋抑菌劑特點：

用來消毒水浴鍋，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。

用法：

1）建議每周進行一次系統(tǒng)地清潔和消毒水浴鍋。

2）稀釋500倍即可使用，即將1升水中加入2mL的水浴鍋防菌劑。

2、細胞房空氣消毒方法

空氣污染不容小覷，氣溶膠污染也是細胞房常見的污染途徑，小愛整理了常見的空氣消毒方法如下：

3、細胞房地面消毒方法

地面是細胞房最常忽略的地方，通常，腳底帶來的微生物污染也是導致細胞房污染爆發(fā)的關鍵因素之一，小愛整理了常用的地面清潔劑，供大家參考。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

注：文中部分圖源于網(wǎng)絡，僅供學習參考用。

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