生物標(biāo)本本質(zhì)上具有三維特性。因?yàn)榭梢姽庠谏锝M織中具有較弱的穿透深度,因此傳統(tǒng)生物學(xué)需將三維組織進(jìn)行二維切片,以減少離焦面信息對目標(biāo)深度的影響。因此基于石蠟切片的二維成像成為了生命科學(xué)研究中的觀測工具。然而,二維切片具有難以避免的局限性(如圖1所示)。
場景1:盤繞彎曲形狀的三維形態(tài)
場景2:復(fù)雜細(xì)胞分布的評估
場景3:檢測稀有或稀疏物體,識別稀有細(xì)胞或藥物靶標(biāo)
如:基因標(biāo)記的稀有細(xì)胞、藥物在靶點(diǎn)研究中的生物分布、干細(xì)胞/祖細(xì)胞研究及PDX 模型中的子克隆等。
三維非切片成像技術(shù)可多次成像同一組織樣本。處理大樣本時,焦平面上下區(qū)域的失焦信息可能干擾成像質(zhì)量。1988年,Marvin Minsky研發(fā)了共聚焦顯微鏡,通過小孔過濾非焦面光信號,開啟了“光學(xué)虛擬切片”技術(shù)。隨后,激光掃描共聚焦顯微鏡、激光掃描雙光子顯微鏡和轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡等技術(shù)逐步商業(yè)化(如圖2)。
真正意義上使用光來進(jìn)行“切片”的技術(shù)—光片顯微鏡(Light Sheet Microscope,圖2C),其歷史可追溯到1903年。
1990年代,華盛頓大學(xué)Francis實(shí)驗(yàn)室研發(fā)了正交平面熒光光學(xué)切片裝置(OPFOS),實(shí)現(xiàn)了對整個耳蝸的清晰熒光圖像捕捉,為相關(guān)研究領(lǐng)域提供了技術(shù)支撐(Spelman F. A., J. Microsc. 1993)。
2004年,Jan Huisken在《Science》上發(fā)表了關(guān)于SPIM技術(shù)的論文,推動了光片顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步和現(xiàn)代化應(yīng)用,并凸顯了其在胚胎發(fā)育研究中的實(shí)用性。該論文提供了青鳉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞搏動和果蠅胚胎發(fā)育的熒光圖像作為實(shí)證。
光片顯微鏡兼具低光損傷、高成像對比度、大視野、深度采樣、三維成像速度快的顯微成像儀器。
2014年,光片成像技術(shù)被Nature methods選為Method of the Year 2014。
光學(xué)切片技術(shù)的進(jìn)步推動了熒光三維成像成為20世紀(jì)末顯微鏡,成像深度從幾十微米提升至幾分之一毫米(Denk等,1990)?;蚓幋a熒光蛋白提供了高特異性標(biāo)記方法,無需抗體擴(kuò)散,實(shí)現(xiàn)了更深入成像(Chalfie等人,1994)。但組織異質(zhì)性導(dǎo)致的光散射阻礙了厚組織高分辨率三維成像研究。
2013年,斯坦福大學(xué)Deisseroth實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的CLARITY技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小鼠全腦透明,獲取了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3D圖像,入選Science雜志?!禢ature》評論稱腦組織切片研究時代或終結(jié)。
CLARITY技術(shù)通過生化試劑去除光散射組分,實(shí)現(xiàn)組織光學(xué)均質(zhì)性,保持完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子組成,改變大腦研究方式。該技術(shù)逐漸擴(kuò)展至多類型方法和器官系統(tǒng)應(yīng)用。
3、水凝膠方案:如CLARITY、SHIELD、PACT等(圖6 D)。
對于動物組織器官來說,無論是哪種透明化方案,最核心的步驟都含有:預(yù)處理(脫色、脫鈣等)、脫脂、染色和折射率匹配四個步驟。
光學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)空間生物學(xué)的多尺度成像,軸向分辨率較傳統(tǒng)光片系統(tǒng)有明顯提升。此外,該技術(shù)還具備倒置成像、折射率匹配系統(tǒng),確保從亞微米到毫米級別的跨尺度成像,該設(shè)備以其各向同性分辨率、低光損傷、高成像對比度等特點(diǎn),為生物學(xué)研究提供了一個全新的觀察窗口。
1、 三維病理學(xué)(H&E/PAS/MASSON及免疫組化/免疫熒光)
2、 神經(jīng)生物學(xué)
3、 臟器、血管、淋巴管及骨骼三維結(jié)構(gòu)
4、 胚胎發(fā)育(線蟲、斑馬魚、小鼠胚胎)
5、 3D細(xì)胞培養(yǎng)、類器官
6、 植物學(xué)
參考文獻(xiàn):
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。