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          無需切片的三維大組織成像研究

          來源:深圳明準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司   2024年11月25日 09:41  
          空間組學(xué)、空間生物學(xué)技術(shù)發(fā)展日新月異,對生物特征的觀測正逐漸從二維推向三維升級。以神經(jīng)系統(tǒng)為例,其復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)難以通過二維切片進(jìn)行完整觀測。傳統(tǒng)三維信息獲取方法依賴串行薄片重建,其技術(shù)挑戰(zhàn)大,耗時長,容錯率低,易導(dǎo)致信息丟失或變形,難以獲得理想體積重建效果。


          無需切片的三維大組織成像研究
          生物大樣本三維非切片跨尺寸成像時代

          生物標(biāo)本本質(zhì)上具有三維特性。因?yàn)榭梢姽庠谏锝M織中具有較弱的穿透深度,因此傳統(tǒng)生物學(xué)需將三維組織進(jìn)行二維切片,以減少離焦面信息對目標(biāo)深度的影響。因此基于石蠟切片的二維成像成為了生命科學(xué)研究中的觀測工具。然而,二維切片具有難以避免的局限性(如圖1所示)。

          無需切片的三維大組織成像研究

          圖1. 二維切片與三維整體結(jié)構(gòu)的對比圖[1]

          場景1:盤繞彎曲形狀的三維形態(tài)

          如:脈管系統(tǒng)、神經(jīng)元、淋巴管、腺體等。

          場景2:復(fù)雜細(xì)胞分布的評估

          如:腫瘤、纖維化、免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病等復(fù)雜結(jié)構(gòu)(微環(huán)境)。

          場景3:檢測稀有或稀疏物體,識別稀有細(xì)胞或藥物靶標(biāo)

          如:基因標(biāo)記的稀有細(xì)胞、藥物在靶點(diǎn)研究中的生物分布、干細(xì)胞/祖細(xì)胞研究及PDX 模型中的子克隆等。

          無需切片的三維大組織成像研究
          光片顯微鏡在三維成像中具有顯著優(yōu)勢

          無需切片的三維大組織成像研究

          圖2. 三維非切片成像技術(shù)對比[2]

          三維非切片成像技術(shù)可多次成像同一組織樣本。處理大樣本時,焦平面上下區(qū)域的失焦信息可能干擾成像質(zhì)量。1988年,Marvin Minsky研發(fā)了共聚焦顯微鏡,通過小孔過濾非焦面光信號,開啟了“光學(xué)虛擬切片”技術(shù)。隨后,激光掃描共聚焦顯微鏡、激光掃描雙光子顯微鏡和轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡等技術(shù)逐步商業(yè)化(如圖2)。

          真正意義上使用光來進(jìn)行“切片”的技術(shù)—光片顯微鏡(Light Sheet Microscope,圖2C),其歷史可追溯到1903年。

          無需切片的三維大組織成像研究

          圖3. OPFOS(左)和SPIM(右)技術(shù)原理[3,4]

          1990年代,華盛頓大學(xué)Francis實(shí)驗(yàn)室研發(fā)了正交平面熒光光學(xué)切片裝置(OPFOS),實(shí)現(xiàn)了對整個耳蝸的清晰熒光圖像捕捉,為相關(guān)研究領(lǐng)域提供了技術(shù)支撐(Spelman F. A., J. Microsc. 1993)。

          2004年,Jan Huisken在《Science》上發(fā)表了關(guān)于SPIM技術(shù)的論文,推動了光片顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步和現(xiàn)代化應(yīng)用,并凸顯了其在胚胎發(fā)育研究中的實(shí)用性。該論文提供了青鳉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞搏動和果蠅胚胎發(fā)育的熒光圖像作為實(shí)證。

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          圖4. 共聚焦和光片顯微鏡工作原理對比[5]

          光片顯微鏡兼具低光損傷、高成像對比度、大視野、深度采樣、三維成像速度快的顯微成像儀器。

          2014年,光片成像技術(shù)被Nature methods選為Method of the Year 2014。

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          生物大樣本成像挑戰(zhàn)

          光學(xué)切片技術(shù)的進(jìn)步推動了熒光三維成像成為20世紀(jì)末顯微鏡,成像深度從幾十微米提升至幾分之一毫米(Denk等,1990)?;蚓幋a熒光蛋白提供了高特異性標(biāo)記方法,無需抗體擴(kuò)散,實(shí)現(xiàn)了更深入成像(Chalfie等人,1994)。但組織異質(zhì)性導(dǎo)致的光散射阻礙了厚組織高分辨率三維成像研究。

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          圖5. 生物組織中影響光傳播的因素[6]
          無需切片的三維大組織成像研究
          組織透明化技術(shù)

          2013年,斯坦福大學(xué)Deisseroth實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的CLARITY技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小鼠全腦透明,獲取了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3D圖像,入選Science雜志?!禢ature》評論稱腦組織切片研究時代或終結(jié)。

          CLARITY技術(shù)通過生化試劑去除光散射組分,實(shí)現(xiàn)組織光學(xué)均質(zhì)性,保持完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子組成,改變大腦研究方式。該技術(shù)逐漸擴(kuò)展至多類型方法和器官系統(tǒng)應(yīng)用。

          組織透明化技術(shù)已發(fā)展出多種方案,總體分三類:

          無需切片的三維大組織成像研究

          圖6. 組織透明化技術(shù)分類[7]
          1、有機(jī)溶劑方案:如BABB、PEGASOS、iDISCO等(圖6 A);
          2、水性溶液方案:如Scale、Ce3D、CUBIC系列等(圖6 B、C);

          3、水凝膠方案:如CLARITY、SHIELD、PACT等(圖6 D)。

          對于動物組織器官來說,無論是哪種透明化方案,最核心的步驟都含有:預(yù)處理(脫色、脫鈣等)、脫脂、染色折射率匹配四個步驟。

          在選擇研究方案時要衡量許多因素,比如樣本類型,透明程度、熒光保護(hù)、抗體(探針)兼容、樣本處理和染色時間等,明準(zhǔn)醫(yī)療推出定制化的組織透明化方案及高性能光片顯微鏡成像一站式服務(wù),為您提供基于三維無損結(jié)構(gòu)的生物學(xué)跨尺寸成像研究新思路。

          新一代光片顯微鏡
          明準(zhǔn)Pano One系統(tǒng)
          無需切片的三維大組織成像研究

          光學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)空間生物學(xué)的多尺度成像,軸向分辨率較傳統(tǒng)光片系統(tǒng)有明顯提升。此外,該技術(shù)還具備倒置成像、折射率匹配系統(tǒng),確保從亞微米到毫米級別的跨尺度成像,該設(shè)備以其各向同性分辨率、低光損傷、高成像對比度等特點(diǎn),為生物學(xué)研究提供了一個全新的觀察窗口。

          無需切片的三維大組織成像研究
          研究&應(yīng)用方向


          1、 三維病理學(xué)(H&E/PAS/MASSON及免疫組化/免疫熒光)

          2、 神經(jīng)生物學(xué)

          3、 臟器、血管、淋巴管及骨骼三維結(jié)構(gòu)

          4、 胚胎發(fā)育(線蟲、斑馬魚、小鼠胚胎)

          5、 3D細(xì)胞培養(yǎng)、類器官

          6、 植物學(xué)

          服務(wù)試用


          無需切片的三維大組織成像研究









          公司介紹

          深圳明準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司(Shenzhen Intoto-biotech Technology Co., Ltd.)是一家專注于顯微成像儀器研發(fā)和科研服務(wù)的高科技企業(yè)。公司依托光片顯微鏡技術(shù),為生物學(xué)研究提供多尺度成像解決方案,助力科研人員深入探索生命科學(xué)的奧秘。



          參考文獻(xiàn):

          1. Liu, J.T.C., Glaser, A.K., Bera, K. et al. Harnessing non-destructive 3D pathology. Nat Biomed Eng 5, 203–218 (2021).
          2. Ronzitti E, Emiliani V and Papagiakoumou E (2018) Methods for Three-Dimensional All-Optical Manipulation of Neural Circuits. Front. Cell. Neurosci. 12:469.
          3.Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A., Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 1993, 170, 229–236.
          4.Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H., Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 2004, 305, 1007–1009.
          5.Jan Huisken, Didier Y. R. Stainier; Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development 15 June 2009; 136 (12): 1963–1975
          6.Tian T, Yang Z, Li X, et al. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. (2021).
          7.Douglas S. Richardson, Jeff W. Lichtman, Clarifying Tissue Clearing. Cell (2015).










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