摘要本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)采用一種基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)的數(shù)據(jù)非依賴型采集方法，結(jié)合固相萃取凈化和農(nóng)藥高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)與譜圖庫(kù)查詢的多農(nóng)殘分析策略，開展 2020 年度歐盟農(nóng)藥殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目中關(guān)于洋蔥基質(zhì)中無(wú)清單農(nóng)藥的定性篩查和基于清單農(nóng)藥的定量篩查（EUPT-SM12 和 EUPT-FV22）?；跉W盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農(nóng)藥，在洋蔥基質(zhì)中對(duì)該分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法對(duì)其中 165 種農(nóng)藥的篩查限、定量限、線性、加標(biāo)回收率和精密度均較為滿意，滿足對(duì)這些農(nóng)藥定性篩查和準(zhǔn)確定量測(cè)定的方法合格性要求。應(yīng)用所述方法對(duì) SM12 和FV22 樣品進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所篩查出的農(nóng)藥化合物與組織方添加的農(nóng)藥一致，無(wú)假陽(yáng)性和假陰性，并且對(duì)于要求定量篩查的 FV22 樣品的定量結(jié)果準(zhǔn)確，表明該方法能夠滿足歐盟關(guān)于農(nóng)藥非靶向定性篩查和基于清單化合物的定量篩查的要求。

前言目前有超過 1000 種農(nóng)藥用于防治農(nóng)作物的病蟲草害，不當(dāng)使用會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留于各類農(nóng)產(chǎn)品中，可能對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成潛在威脅。因此，食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留一直是全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。為確保監(jiān)測(cè)結(jié)果的可靠性，依據(jù)歐盟法規(guī) 396/2005/EC，所有在歐盟法規(guī)控制框架下的農(nóng)殘檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室每年均需要參加由歐盟健康與消費(fèi)者保護(hù)委員會(huì) (DG-SANCO) 組織的農(nóng)殘能力測(cè)試。歐盟參比實(shí)驗(yàn)室 (EURL) 根據(jù)歐盟法規(guī) Reg. 882/2004/EC代表 DG-SANCO 組織年度關(guān)于農(nóng)殘檢測(cè)的能力驗(yàn)證項(xiàng)目（簡(jiǎn)稱EUPT）。該驗(yàn)證項(xiàng)目有助于了解相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量、準(zhǔn)確度以及各實(shí)驗(yàn)室間的可比性。歐盟域外實(shí)驗(yàn)室經(jīng) DGSANCO 許可后可以參加該能力驗(yàn)證項(xiàng)目。目前，色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法仍是農(nóng)殘檢測(cè)的方法。但使用該方法時(shí)，需要針對(duì)每種化合物預(yù)先編輯其待采集的特征離子對(duì)；再者，由于分辨率較低，使得利用三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性；另外，能夠檢測(cè)的農(nóng)藥數(shù)量也受到儀器掃描速率的限制，且無(wú)法對(duì)采集清單之外的農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)。因此，為了提高復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)能力，并實(shí)現(xiàn)對(duì)采集清單外的農(nóng)藥進(jìn)行回溯性篩查，我們?cè)谶^去十余年中一直致力于采用色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用手段來開展農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留篩查。相繼開發(fā)出用于蘋果、番茄、紫甘藍(lán)、芒果、香蕉、棉籽殼等各類農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的高通量定性篩查與準(zhǔn)確定量方法[1-4]。

本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了 2020 年度參與 EUPT 關(guān)于洋蔥基質(zhì)中的農(nóng)藥篩查與測(cè)定的結(jié)果?；?2020 年度歐盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農(nóng)藥，在洋蔥基質(zhì)中對(duì)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的多農(nóng)殘同時(shí)定性篩查與準(zhǔn)確定量的策略與方法[2] 進(jìn)行篩查限、定量限、線性、加標(biāo)回收率和精密度等方法性能評(píng)價(jià)；然后利用該方法對(duì)EUPT-SM12 和 EUPT-FV22 樣品進(jìn)行篩查。所篩查出的農(nóng)藥種類和定量結(jié)果與歐盟組織方公布的添加農(nóng)藥種類及含量一致，表明所開發(fā)的多農(nóng)殘篩查與定量方法準(zhǔn)確可靠，能夠滿足歐盟對(duì)農(nóng)藥殘留的非靶向篩查和準(zhǔn)確定量監(jiān)測(cè)的要求。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品所有 173 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司，純度≥ 98%；甲酸和醋酸銨均為 LC/MS 級(jí)，購(gòu)自美國(guó) Merck 公司；乙腈和甲苯均為色譜純，購(gòu)自美國(guó) Fisher 公司；乙酸、無(wú)水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；EUPT-SM12（簡(jiǎn)稱“SM12”）和 EUPT-FV22（簡(jiǎn)稱“FV22”）樣品由 EUPT 組織方提供。用于方法學(xué)評(píng)價(jià)的洋蔥樣品基質(zhì)購(gòu)自本地市場(chǎng)。

儀器和設(shè)備采用 Agilent 1290 Infinity II 二元液相色譜系統(tǒng)對(duì)農(nóng)藥化合物進(jìn)行超高效分離。該色譜系統(tǒng)配備如下安捷倫模塊：1290 Infinity II 二元高壓梯度泵、1290 Infinity II 自動(dòng)進(jìn)樣器和 1290 Infinity II 柱溫箱。色譜柱的流出液轉(zhuǎn)入 Agilent 6545A 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所用的 Carbon/NH2 固相萃取小柱（500 mg/500 mg，部件號(hào) 12252202）為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品，所用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm，部件號(hào)861775-902）。

定性篩查EUPT 組織方提供的 SM12 樣品僅要求提供定性篩查結(jié)果，F(xiàn)V22樣品則要求基于 EUPT 提供的清單同時(shí)提供定性和定量篩查結(jié)果。因此，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)這兩種樣品按上述樣品前處理方法進(jìn)行處理，得到待測(cè)溶液；然后采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)在全離子 MS/MS 模式下采集數(shù)據(jù)，對(duì)采集得到的結(jié)果進(jìn)行定性篩查。對(duì)于 SM12 樣品，依據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的農(nóng)藥化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)與譜庫(kù)（農(nóng)藥 PCDL 庫(kù)，包含超過 810 種化合物）進(jìn)行分子式查找，同時(shí)選擇碎片離子進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于 FV22 定量篩查樣品，則在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的農(nóng)藥 PCDL 庫(kù)的基礎(chǔ)上，建立針對(duì) FV22 篩查清單的 PCDL 子庫(kù)，然后利用該 PCDL 子庫(kù)進(jìn)行母離子（定量離子）查找以及碎片離子確認(rèn)。定性篩查指標(biāo)參考SANTE/12682/2019 指南[6] 并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，化合物的確認(rèn)需要滿足以下條件：包括 1 個(gè)母離子和至少 1 個(gè)碎片離子，且這些離子的質(zhì)量偏差需要在 10 ppm 以內(nèi)；母離子與碎片離子共流出，且保留時(shí)間與庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在相同色譜條件下的保留時(shí)間偏差在0.35 min 以內(nèi)。對(duì)于質(zhì)量偏差在 5–10 ppm 以內(nèi)的化合物，則需進(jìn)一步人工查驗(yàn)確認(rèn)。方法的篩查限 (SDL) 基于上述篩查指標(biāo)要求，采用本地市場(chǎng)采購(gòu)的無(wú)陽(yáng)性檢出的洋蔥樣品作為空白基質(zhì)，分別以 1、5、10、25和 50 µg/kg 的濃度水平進(jìn)行 173 種農(nóng)藥的加標(biāo)測(cè)試。每個(gè)濃度水平做 20 組平行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)圖 1 所示的樣品提取與凈化過程，在本文所述的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，并按上述化合物確認(rèn)需要滿足的條件進(jìn)行篩查閾值的設(shè)置。如果某個(gè)濃度水平下有 95%或以上的樣品中篩查出某種目標(biāo)化合物，則認(rèn)為該濃度為此化合物的篩查限。

定量測(cè)定對(duì)于定量限和線性范圍的確定，首先按照?qǐng)D 1 制備空白基質(zhì)，在最后一步溶解殘?jiān)鼤r(shí)向其中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成1、5、10、25、50、100、200 μg/kg 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，然后進(jìn)行樣品測(cè)定。選擇分子加合離子峰（母離子）計(jì)算 S/N。將 S/N 滿足 ≥ 10 所對(duì)應(yīng)的低加標(biāo)濃度水平定為目標(biāo)化合物的定量限 (LOQ)；并以母離子的提取色譜峰面積對(duì)添加濃度進(jìn)行作圖，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。采用空白洋蔥樣品作為驗(yàn)證基質(zhì)，分別在 1 × LOQ、2 × LOQ 和10 × LOQ 三個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定 5 次，用以評(píng)估方法的準(zhǔn)確度和精密度。對(duì)于定性篩查小節(jié)中在 FV22 樣品中定性篩查得到的農(nóng)藥，以上述基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正曲線對(duì)篩查到的農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

結(jié)果與討論2020 年度歐盟農(nóng)殘能力驗(yàn)證中的 FV22 項(xiàng)目是基于歐盟公開的農(nóng)藥清單（2020 年度的清單包括 208 種強(qiáng)制農(nóng)藥清單和 36 種自愿農(nóng)藥清單，共 244 種）的篩查與準(zhǔn)確定量。利用本實(shí)驗(yàn)室基于LC-QTOF/MS 平臺(tái)所開發(fā)的檢測(cè)方法，首先開展針對(duì)歐盟清單化合物的定性和定量篩查方法評(píng)價(jià)。在上述包含 244 種化合物的清單中，利用根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)判斷適合電噴霧正離子模式離子化特征的 173 種農(nóng)藥，對(duì)定性和定量篩查方法的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。其它71 種化合物適合電噴霧負(fù)離子模式離子化或 EI 離子化，不在本文討論的范圍內(nèi)。

方法的篩查限 (SDL)、定量限 (LOQ) 與標(biāo)準(zhǔn)曲線按照前述篩查限測(cè)定的方法，得到 173 種農(nóng)藥化合物的篩查限如圖 2A 中以“×”標(biāo)記的數(shù)據(jù)點(diǎn)所示。其中 96.5%（167 種）的農(nóng)藥的篩查限在 1–5 µg/kg 范圍內(nèi)，且有 132 種 (76.3%) 農(nóng)藥的篩查限不高于 1 µg/kg。其余 6 種 (3.5%) 農(nóng)藥的篩查限相對(duì)較高，其中 5 種農(nóng)藥（保棉磷、丙硫磷、氟胺氰菊酯、甲基立枯磷和仲丁威）的篩查限在 25 µg/kg 的水平，1 種農(nóng)藥（異噁唑草酮）的篩查限在 50 µg/kg 的水平。表明該方法對(duì)于測(cè)試清單中適用電噴霧正離子化的絕大部分農(nóng)藥的篩查靈敏度較高，滿足歐盟對(duì)于這些農(nóng)藥篩查的 10 µg/kg 的一律標(biāo)準(zhǔn)，以及針對(duì)個(gè)別化合物（例如樂果、氧樂果和毒死蜱等）的更低的標(biāo)準(zhǔn) (3–5 µg/kg)。173 種農(nóng)藥的定量限如圖 2A 中以“o”標(biāo)記的數(shù)據(jù)點(diǎn)所示。從圖中可以看出，上述 SDL 在 1–5 µg/kg 范圍內(nèi)的 167 種農(nóng)藥的 LOQ均不高于 10 µg/kg 的一律標(biāo)準(zhǔn)和針對(duì)個(gè)別化合物的更低的標(biāo)準(zhǔn)；且上述篩查限較高的 6 種農(nóng)藥中的兩種（保棉磷和仲丁威）的LOQ 在 25 µg/kg 水平，其余 4 種農(nóng)藥的 LOQ 則不高于 50 µg/kg?；|(zhì)加標(biāo)溶液測(cè)定的結(jié)果表明，所考察的農(nóng)藥化合物在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，超過 90% 的農(nóng)藥化合物的線性回歸方程決定系數(shù) R2 均大于 0.99，個(gè)別化合物的 R2 略低于 0.99，但均大于0.98，如圖 2B 所示。