文章作者： 彪彪 文章來(lái)源：抗體圈

摘要：將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主患者體內(nèi)以獲得治療益處的概念已經(jīng)有超過(guò)半個(gè)世紀(jì)的歷史。然而，直到2017年，隨著美國(guó)FDA批準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞療法，隨后歐盟也批準(zhǔn)了這一療法，這一概念才成為臨床現(xiàn)實(shí)。自產(chǎn)品獲批以來(lái)，已有更多基因療法上市，而且處于晚期臨床試驗(yàn)階段的產(chǎn)品數(shù)量表明，基因療法可能成為生物制藥行業(yè)增長(zhǎng)最快的領(lǐng)域之一。對(duì)于任何生物制藥產(chǎn)品的商業(yè)成功來(lái)說(shuō)，能夠經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模生產(chǎn)治療產(chǎn)品以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求是一個(gè)關(guān)鍵因素。迄今為止，制造過(guò)程已經(jīng)能夠在必要的規(guī)模上生產(chǎn)滿(mǎn)足臨床研究需求的基因治療病毒載體。然而，為了滿(mǎn)足商業(yè)需求，尤其是對(duì)于治療患者群體龐大的疾病的療法，當(dāng)前的生物制造過(guò)程需要擴(kuò)大規(guī)模和優(yōu)化。

1.介紹

基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞以替代缺失或有缺陷的基因，并且轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)能夠提供治療益處的概念最早由西奧多·弗里德曼（Theodore Friedmann）提出，第一個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)是在1970年進(jìn)行的?；蛑委熥畛醣辉O(shè)想為一種治療遺傳病的方法。然而，也構(gòu)想了替代策略來(lái)治療其他具有遺傳成分的疾病。當(dāng)前的基因治療模型包括：（i）基因替代，傳遞一個(gè)功能性基因以替代一個(gè)不起作用的基因；（ii）基因沉默，使一個(gè)對(duì)細(xì)胞有毒的突變基因失活；（iii）基因添加，過(guò)度表達(dá)一個(gè)“外來(lái)”或外源基因以影響細(xì)胞功能；以及（iv）基因編輯，對(duì)患者基因組中的基因進(jìn)行操作。

在過(guò)去50年中，基因治療經(jīng)歷了過(guò)山車(chē)般的發(fā)展，許多進(jìn)步之后伴隨著挫折。1980年，隨著重組DNA的出現(xiàn)，科學(xué)家們證明了可以在體外用rDNA轉(zhuǎn)化小鼠骨髓細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞注射到經(jīng)過(guò)輻射的小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生主導(dǎo)的骨髓群體。同樣的技術(shù)也被用來(lái)轉(zhuǎn)化兩名患有遺傳性疾病β-地中海貧血患者的骨髓細(xì)胞，使用重組人類(lèi)β-珠蛋白基因。第一個(gè)涉及人類(lèi)患者的試驗(yàn)使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的腺苷脫氨酶（ADA）基因轉(zhuǎn)移到兩名患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的兒童的T細(xì)胞中?？傮w而言，結(jié)果是肯定的，并提供了概念驗(yàn)證，即基因治療對(duì)某些患者是一種安全有效的治療方法。然而，1999年杰西·格爾（Jesse Gelsinger），一名18歲患有較輕微的氮代謝障礙鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OT）缺乏癥的青年，在參加基因治療試驗(yàn)時(shí)因腺病毒載體相關(guān)毒性死亡，這表明了與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的科學(xué)復(fù)雜性。在五名患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷-X1（SCID-X1）的患者體外轉(zhuǎn)染CD34+細(xì)胞后發(fā)展成白血病，其中一人死亡，進(jìn)一步引發(fā)了擔(dān)憂(yōu)，這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)染了編碼γ鏈細(xì)胞因子受體亞單位的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這項(xiàng)研究包括了20名患者，基因治療確實(shí)為兩名患者提供了的疾病表型糾正。中國(guó)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)在2003年批準(zhǔn)了商業(yè)化的基因治療產(chǎn)品Gendicine，用于治療頭頸鱗狀細(xì)胞癌，這是一種皮膚癌。Gendicine是一種經(jīng)過(guò)工程改造的病毒，攜帶有制造抗腫瘤蛋白的基因指令。這種產(chǎn)品在中國(guó)以外沒(méi)有獲得批準(zhǔn)，直到2012年歐洲才批準(zhǔn)了第一個(gè)基因治療產(chǎn)品Glybera。Glybera利用一種重組腺相關(guān)病毒（AAV），可用于治療家族性脂蛋白脂肪酶缺乏癥（LPLD）。然而，由于LPLD是一種罕見(jiàn)疾病，患者數(shù)量極少，這種藥物無(wú)利可圖。因此，制造商拒絕更新市場(chǎng)授權(quán)，Glybera在2017年退出市場(chǎng)。2017年8月30日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了tisagenlecleucel（Kymriah），這是第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的基因治療產(chǎn)品。Kymriah是一種針對(duì)CD19的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞免疫療法，用于治療年齡≤25歲的B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）患者，這些患者對(duì)治療有抗性，處于第二次或更晚的復(fù)發(fā)狀態(tài)。Kymriah隨后在2018年獲得歐盟批準(zhǔn)。表14.1提供了截至2022年12月FDA批準(zhǔn)的所有基因治療產(chǎn)品的列表。

轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的三種通用協(xié)議（如圖14.1所示）：體外、體內(nèi)和原位。在體外基因轉(zhuǎn)移中，患者的細(xì)胞被分離并用治療基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在被重新輸回患者之前進(jìn)行擴(kuò)增。這種方法已有效地用于兒童白血病的CAR-T細(xì)胞治療。雖然體外基因治療對(duì)治療血液疾病有效，但體內(nèi)基因治療對(duì)治療腦部、脊髓或肝臟疾病更有效。體內(nèi)基因治療直接將基因載體注入宿主，通過(guò)循環(huán)血液或腦脊液，在全身范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞。主要使用兩種類(lèi)型的病毒載體：腺病毒（AdV）載體和腺相關(guān)病毒（AAV）載體。與體內(nèi)基因治療類(lèi)似，原位基因治療直接向宿主患者引入載體；然而，主要區(qū)別在于載體是被施用于患者的特定器官或區(qū)域，而不是靜脈注射。

圖 14.1 傳遞治療基因和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法。

與體內(nèi)基因治療相比，這種方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，比如減少潛在的副作用、降低載體劑量的需求，以及因此而降低的成本。任何基因治療策略成功的關(guān)鍵在于擁有一個(gè)能夠作為安全且高效基因傳遞工具的載體。治療性基因可以通過(guò)病毒載體或非病毒載體傳遞給細(xì)胞。研究最多的非病毒載體是聚合物、脂質(zhì)、無(wú)機(jī)顆?；虿煌?lèi)型的組合。與病毒載體相比，非病毒載體在細(xì)胞毒性、免疫原性和致突變性方面較低。然而，非病毒載體并不具備理想的特性，并且面臨諸如基因轉(zhuǎn)移效率、特異性、基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間和安全性等關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前FDA批準(zhǔn)的基因治療中沒(méi)有使用非病毒載體。相比之下，病毒具有復(fù)雜而精確的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)自然進(jìn)化調(diào)整，以高效轉(zhuǎn)染特定的宿主細(xì)胞或組織。目前FDA批準(zhǔn)的基因治療中使用幾種病毒作為基因傳遞載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（由小鼠白血病病毒（MLV）衍生的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和主要來(lái)自HIV-1的慢病毒載體（LV））、腺病毒、腺相關(guān)病毒和單純皰疹病毒1型。這些病毒載體的典型特征總結(jié)在表14.2中。病毒載體的主要限制是非優(yōu)化過(guò)程的產(chǎn)量相對(duì)較低。要使病毒基因治療在臨床和商業(yè)上取得成功，必須有能夠高效和經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)病毒的生物制造系統(tǒng)，以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。

2.慢病毒

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一個(gè)亞科。與其他病毒相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有的特點(diǎn)，它們包含單鏈RNA，在宿主細(xì)胞感染期間會(huì)被逆轉(zhuǎn)錄。與早期臨床試驗(yàn)中作為潛在基因治療載體被廣泛研究的腫瘤病毒亞科不同，慢病毒亞科能夠感染靜止和后有絲分裂細(xì)胞，被歸類(lèi)為復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼是一個(gè)包膜蛋白殼，包含病毒基因組，直徑為80-100納米。圍繞衣殼的包膜結(jié)構(gòu)是一個(gè)脂質(zhì)雙層，包含病毒編碼的表面糖蛋白和源自宿主細(xì)胞的跨膜糖蛋白。慢病毒亞科的基因組是線(xiàn)性的、非分段的、單鏈RNA，長(zhǎng)度為7-12 kb。簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組，如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，包含三個(gè)主要編碼段和一個(gè)小型編碼域。主要段包含三個(gè)基因——gag、pol和env——它們編碼對(duì)病毒整合、復(fù)制和包裝重要的蛋白。小型編碼域包含pro基因，編碼病毒蛋白酶。復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒，的基因組包含與簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒相同的基因（gag、pol和env），但還包含六個(gè)額外的基因——兩個(gè)調(diào)節(jié)基因和四個(gè)輔助基因——它們編碼對(duì)病毒復(fù)制、結(jié)合、感染和釋放重要的蛋白。表14.3概述了這六個(gè)基因及其表達(dá)蛋白的功能。

逆轉(zhuǎn)錄病毒通過(guò)外層包膜上的糖蛋白與特定細(xì)胞受體之間的相互作用感染細(xì)胞。一旦病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合，就會(huì)發(fā)生一系列事件，導(dǎo)致病毒顆粒被納入細(xì)胞脂質(zhì)雙層，隨后病毒遺傳物質(zhì)被卸入細(xì)胞質(zhì)。然而，慢病毒的生命周期中發(fā)生了一些的事件，這解釋了它們能夠感染非分裂細(xì)胞的能力。首先，基因表達(dá)發(fā)生在兩個(gè)獨(dú)立的階段，即早期和晚期，這兩個(gè)階段由rev蛋白的結(jié)合分隔。其次，慢病毒通過(guò)vpr基因表達(dá)的蛋白感染非分裂細(xì)胞。最后，僅在復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒中發(fā)現(xiàn)的tat基因?qū)IV-1的復(fù)制至關(guān)重要。

2.1.慢病毒載體在基因治療中的應(yīng)用

作為基因治療載體研究最多的慢病毒（LV）是人類(lèi)免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。安全性至關(guān)重要，由于HIV-1對(duì)人類(lèi)的致病性，LV載體系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型。幾乎所有的臨床和研究工作，包括用于生產(chǎn)CAR T細(xì)胞的慢病毒載體，都基于第三代包裝系統(tǒng)和自失活（SIN）配置，自第三代慢病毒載體開(kāi)發(fā)以來(lái)，的慢病毒載體的設(shè)計(jì)并沒(méi)有發(fā)生戲劇性的變化。第三代載體基于一個(gè)四質(zhì)粒系統(tǒng)，包括一個(gè)基因轉(zhuǎn)移載體（TV質(zhì)粒）和三個(gè)輔助質(zhì)粒，如圖14.2所示。TV質(zhì)粒是轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，由包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的LV骨干組成，其兩側(cè)是需要用于包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合的順式作用元素。所有輔助基因，nef、vpr、vpu和Vif，都被移除，因?yàn)樗鼈兪遣槐匾?，調(diào)節(jié)tat基因被消除。復(fù)制所需的rev基因以轉(zhuǎn)錄方式提供，以創(chuàng)建一個(gè)條件包裝平臺(tái)。載體被賦予一個(gè)由非常特定的糖蛋白組成的包膜結(jié)構(gòu)，即狂犬病病毒糖蛋白（VSV-G），這使得載體具有高親和力，能夠感染多種細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)刪除包含TATA盒和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的3′-LTR的一部分，安全性得到進(jìn)一步增強(qiáng)。因此，載體包裝系統(tǒng)變得自失活（SIN）。

圖 14.2 第三代不依賴(lài)Tat的慢病毒載體系統(tǒng)的示意圖。所示的SIN轉(zhuǎn)移載體包含cPPT以實(shí)現(xiàn)有效的核輸入，并使用MSCV LTR啟動(dòng)子（MU3）作為內(nèi)部啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，以及WPRE（W）元件以實(shí)現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。三個(gè)包裝構(gòu)建編碼HIV-1的gag-pol和rev蛋白以及VSV-g包膜糖蛋白。

2.2.生產(chǎn)細(xì)胞系

大多數(shù)當(dāng)前的LV載體生產(chǎn)系統(tǒng)涉及對(duì)HEK293或HEK293T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)染含有g(shù)ag-pol、env、rev和TV質(zhì)粒的四個(gè)質(zhì)粒。與HEK293細(xì)胞系相比，HEK293T細(xì)胞系產(chǎn)生更高的病毒滴度，因此是的生產(chǎn)平臺(tái)。HEK293細(xì)胞系和HEK293T細(xì)胞系之間的區(qū)別是后者攜帶腫瘤病毒SV40大T抗原。表達(dá)SV40 T-抗原的細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染效率增加的機(jī)制尚不清楚，但這一現(xiàn)象也在CV-1（SV40 T-抗原陰性）和COS-1（SV40 T-抗原陽(yáng)性）細(xì)胞之間得到證實(shí)。然而，SV40 T-抗原是腫瘤病毒，因此帶來(lái)了一些安全問(wèn)題。使用四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法在病毒滴度上的批次間變異性也是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。第一個(gè)成功的穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系之一是STAR包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系是通過(guò)將HEK293T細(xì)胞與編碼密碼子優(yōu)化的gag-pol基因的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染，隨后引入HIV-1調(diào)節(jié)蛋白Tat和Rev的基因、一個(gè)包膜蛋白和一個(gè)HIV-1 LV載體。優(yōu)化轉(zhuǎn)染載體基因組表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了SIN LV載體生產(chǎn)細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)。與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括批次間的可重復(fù)性、可擴(kuò)展性和成本?；贖IV-1的LV載體開(kāi)發(fā)穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系已被證明是具有挑戰(zhàn)性的。包裝基因和與HIV-1基礎(chǔ)LV載體發(fā)生的基因沉默在長(zhǎng)期培養(yǎng)期間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。為克服這一限制，采用了兩種不同的策略。第一種策略使用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)控制VSV-G和gal-pol基因的表達(dá)。替代誘導(dǎo)型穩(wěn)定細(xì)胞系的策略是創(chuàng)建組成型包裝細(xì)胞系。這些已經(jīng)為一些比VSV-G毒性小的包膜蛋白開(kāi)發(fā)出來(lái)，如cocal和RD114-TR。

2.3.慢病毒載體生產(chǎn)

慢病毒載體在幾種FDA批準(zhǔn)的基因治療中得到應(yīng)用。如表14.1所示，這些治療都采用體外基因轉(zhuǎn)移，并且劑量要求高達(dá)10^9個(gè)CAR-T陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)FDA指南，CAR-T陽(yáng)性細(xì)胞被視為最終治療產(chǎn)品（在歐盟也稱(chēng)為藥品），而LV載體被視為關(guān)鍵原材料。盡管最終的細(xì)胞產(chǎn)品是自體的，并且必須為每個(gè)患者單獨(dú)生產(chǎn)，但LV載體可以大量生產(chǎn)，并在-80°C下冷凍保存數(shù)年。

慢病毒載體的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)可以通過(guò)擴(kuò)展（即增加輔助生產(chǎn)系統(tǒng)）支持錨定依賴(lài)細(xì)胞的小規(guī)模系統(tǒng)，或者通過(guò)擴(kuò)展支持懸浮細(xì)胞擴(kuò)增的系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前，大多數(shù)大規(guī)模生產(chǎn)依賴(lài)于錨定依賴(lài)細(xì)胞。由于HEK293細(xì)胞是弱錨定依賴(lài)的，滾筒瓶培養(yǎng)并不普遍。生產(chǎn)是在多托盤(pán)系統(tǒng)的平行培養(yǎng)中進(jìn)行的——無(wú)論是細(xì)胞工廠(chǎng)還是細(xì)胞堆疊。系統(tǒng)是10堆疊系統(tǒng)。從理論上講，可以使用40堆疊系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)由于其大小和重量而存在處理問(wèn)題。此外，堆疊之間的質(zhì)量傳遞可能不均勻，這導(dǎo)致溶解氧水平的變化。LV載體收獲次數(shù)可以從一次最終收獲到最多三次收獲，從12-24個(gè)10堆疊細(xì)胞工廠(chǎng)設(shè)備中生產(chǎn)出20-52升。使用細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)LV載體有一些缺點(diǎn)，即收獲窗口有限、勞動(dòng)強(qiáng)度大、在開(kāi)放式系統(tǒng)中保持無(wú)菌以及需要大量的孵化器空間。為此，研究人員已經(jīng)研究了固定床系統(tǒng)、中空纖維生物反應(yīng)器和裝有Fibra-cel圓盤(pán)的Wave生物反應(yīng)器，細(xì)胞被固定在圓盤(pán)上。表14.4比較了在LV載體生產(chǎn)中使用的不同的生產(chǎn)系統(tǒng)。

由于錨定依賴(lài)細(xì)胞在可擴(kuò)展性上的固有限制，HEK-293 T培養(yǎng)物可以適應(yīng)無(wú)血清、懸浮培養(yǎng)，用于慢病毒載體生產(chǎn)，并在傳統(tǒng)的攪拌罐生物反應(yīng)器中使用。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的主要缺點(diǎn)是細(xì)胞密度較低，與錨定依賴(lài)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)相比，病毒滴度降低。使用懸浮培養(yǎng)的初始研究表明，病毒滴度在10^6 TU/mL及以下。通過(guò)在連續(xù)模式下而不是批量模式下運(yùn)行生物反應(yīng)器，LV載體的累積產(chǎn)量可以增加高達(dá)15倍，滴度達(dá)到3.2×10^7 TU/mL，與錨定依賴(lài)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)相當(dāng)。最近的研究通過(guò)在懸浮介質(zhì)中逐漸適應(yīng)，報(bào)告了10^8 TU/mL的LV載體滴度。在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，另一個(gè)考慮因素是從上清液中分離細(xì)胞和病毒。連續(xù)培養(yǎng)利用了聲波細(xì)胞過(guò)濾技術(shù)和切向流深層過(guò)濾（TFDF），這些技術(shù)能夠在生物反應(yīng)器內(nèi)保留細(xì)胞。累積功能產(chǎn)量達(dá)到3.3×10^11和3.9×10^11轉(zhuǎn)導(dǎo)單位；前者在6天的LV生產(chǎn)中，使用了16.3升的灌注介質(zhì)，后者在4天內(nèi)使用了16升。批量培養(yǎng)依賴(lài)于收獲后使用離心和過(guò)濾來(lái)去除細(xì)胞。

3.腺病毒

腺病毒（Ad）最初于1953年在人類(lèi)脂肪組織中被鑒定出來(lái)。有六個(gè)物種（A-F）感染人類(lèi)，進(jìn)一步細(xì)分為五十多種感染性血清型。腺病毒衣殼的球形旋鈕結(jié)構(gòu)對(duì)coxsackie/腺病毒受體（CAR）具有高親和力，該受體可在人體各種細(xì)胞中找到。因此，人類(lèi)腺病毒被認(rèn)為是所有急性呼吸道感染的5-10%的原因。腺病毒的傳染性，以及它們利用細(xì)胞機(jī)制合成病毒mRNA和蛋白的能力，導(dǎo)致腺病毒載體在大約50%的當(dāng)前臨床試驗(yàn)中得到使用。

腺病毒是一種無(wú)包膜病毒?；蚪M是線(xiàn)性的、雙鏈DNA（dsDNA），長(zhǎng)度在26到40 kb之間[73]。這種線(xiàn)性形式在病毒衣殼內(nèi)被組織成緊湊的類(lèi)似核小體的結(jié)構(gòu)，并且在每個(gè)DNA鏈的末端具有類(lèi)似發(fā)夾的倒置末端重復(fù)（ITR）序列。ITRs的長(zhǎng)度不同，可以在末端之間有30到371 bp。如圖14.3所示，病毒基因組包含兩個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，稱(chēng)為早期區(qū)域和晚期區(qū)域?；蚪M的早期區(qū)域包含四個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄單元（E1, E2, E3和E4），這些單元在細(xì)胞感染后被激活。此外，基因組包含兩個(gè)延遲早期轉(zhuǎn)錄單元（IX和IVa2）和一個(gè)主要的晚期（ML）轉(zhuǎn)錄單元，通過(guò)翻譯后處理（從L1到L5）處理生成晚期區(qū)域mRNAs。

圖 14.3 腺病毒5型(Ad5)基因組地圖以及不同代的腺病毒載體。

3.1.腺病毒載體在基因治療中的應(yīng)用

第一代腺病毒載體的基因組中E1A/E1B區(qū)域被多達(dá)4.5 kb的DNA轉(zhuǎn)基因盒替換。E1A蛋白是病毒復(fù)制所必需的。從病毒基因組中刪除這些基因，因此需要開(kāi)發(fā)互補(bǔ)的生產(chǎn)細(xì)胞系，這些細(xì)胞系提供了這些基因，如293, 911, N52.E6或PER.C6。E3區(qū)域?qū)Σ《緩?fù)制并非必需，也可以被刪除以創(chuàng)造額外的空間用于轉(zhuǎn)基因盒。這些消除允許向載體中插入多達(dá)8.3 kb的DNA。第一代腺病毒載體受到兩個(gè)限制的困擾：（i）腺病毒蛋白的新表達(dá)可以激活宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致清除病毒感染的細(xì)胞；（ii）如果在腺病毒載體和生產(chǎn)細(xì)胞的工程E1區(qū)域之間發(fā)生自發(fā)重組，可以在基因擴(kuò)增期間產(chǎn)生具有復(fù)制能力的腺病毒。

除了刪除E1和E3基因外，第二代腺病毒載體還刪除了E2和E4基因。刪除這些額外的基因允許插入多達(dá)14 kb的DNA轉(zhuǎn)基因盒。然而，E2和E4區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄增加病毒編碼基因表達(dá)的蛋白的基因。因此，與第一代腺病毒載體相比，第二代腺病毒載體中治療基因的表達(dá)較低。與第一代載體一樣，細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊并消除體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二代腺病毒載體的細(xì)胞，限制了治療基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。

第三代腺病毒載體，也稱(chēng)為剝離或無(wú)病毒載體，除了ITR和包裝區(qū)域外，所有腺病毒DNA都被移除。這允許向載體中插入36 kb的DNA。復(fù)制需要包裝細(xì)胞與輔助載體（HV）共感染，輔助載體能夠在轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生所有必要的蛋白。剝離的腺病毒載體在表達(dá)HV和Cre重組酶的HEK293生產(chǎn)細(xì)胞中生產(chǎn)。HV蛋白允許剝離載體的復(fù)制和包裝。工程化的Cre確保通過(guò)Cre介導(dǎo)的loxP位點(diǎn)重組，HV基因組包裝信號(hào)被切除，并且只有剝離的腺病毒基因組可以被包裝。

3.2.腺病毒載體生產(chǎn)

幾個(gè)上游過(guò)程參數(shù)影響腺病毒載體生產(chǎn)的數(shù)量和質(zhì)量。這些包括生產(chǎn)細(xì)胞系、病毒感染參數(shù)、細(xì)胞生長(zhǎng)條件和操作模式。這些參數(shù)可以相互影響，需要一個(gè)全面的、系統(tǒng)級(jí)的方法來(lái)優(yōu)化生物制造過(guò)程。

第一代腺病毒載體的生產(chǎn)通常使用HEK293和PER.C6細(xì)胞。HEK293細(xì)胞系是通過(guò)將人類(lèi)胚胎腎（HEK）細(xì)胞與切碎的人類(lèi)Ad5 DNA共轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的，其中核苷酸1-4344，包括E1區(qū)域，被整合到19號(hào)染色體上。這些細(xì)胞非常多功能，可以在懸浮或貼壁狀態(tài)下培養(yǎng)，并且可以使用無(wú)血清或含血清的培養(yǎng)基。據(jù)預(yù)測(cè)，HEK293細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)可以達(dá)到高達(dá)10,000升的規(guī)模，病毒產(chǎn)量在10^9到10^10 VP/mL之間。

HEK293細(xì)胞系的一個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)是在生產(chǎn)過(guò)程中由于同源重組事件頻繁產(chǎn)生具有復(fù)制能力的腺病毒（RCA）。PER.C6細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)旨在減少生產(chǎn)過(guò)程中RCA出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。PER.C6細(xì)胞系包含Ad5 E1A和E1B編碼序列（核苷酸459-3510），在人類(lèi)磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動(dòng)子的控制下。通過(guò)將細(xì)胞與沒(méi)有序列重疊的腺病毒載體結(jié)合，克服了RCA的產(chǎn)生。PER.C6細(xì)胞可以在有無(wú)血清的懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)，已成為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

第二代腺病毒載體，缺乏E1、E2和E4區(qū)域，可以與源自HeLa和Vero細(xì)胞的跨補(bǔ)細(xì)胞系一起生產(chǎn)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)E2缺陷的腺病毒載體和E4缺陷的腺病毒載體?；贖EK293、911和E1修飾的A549細(xì)胞的細(xì)胞系也已被生成，以允許第二代腺病毒載體的傳播。

第三代或無(wú)病毒載體，除了對(duì)病毒DNA復(fù)制和包裝所必需的順式作用序列外，所有基因都被移除。由于需要一個(gè)適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)細(xì)胞系來(lái)提供所有必要的病毒元素，載體生產(chǎn)變得復(fù)雜。一些腺病毒蛋白的細(xì)胞毒性可能是創(chuàng)建補(bǔ)充這些載體的細(xì)胞系工作失敗的最可能原因。因此，有必要提供輔助腺病毒載體（HV），它提供病毒粒子所需的包裝蛋白。生產(chǎn)細(xì)胞系源自293細(xì)胞，并表達(dá)Cre重組酶，而HV被修飾為包含包裝位點(diǎn)周?chē)膌oxP位點(diǎn)。在293Cre細(xì)胞中，包裝信號(hào)被有效地切除，防止輔助病毒基因組被包裝。然而，切除效率，與HV的污染是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，報(bào)告的水平在0.01-1%之間。

腺病毒載體的滴度受到多種因素的影響，包括感染的多重性（MOI）、收獲時(shí)間（TOH）和感染時(shí)的細(xì)胞濃度（CCI）。一旦生產(chǎn)細(xì)胞被腺病毒載體接種，感染可以迅速發(fā)生，大約需要48小時(shí)完成一個(gè)感染周期。因此，制造過(guò)程被配置為單輪感染周期，MOI>1以確保所有細(xì)胞都被感染。應(yīng)為每個(gè)系統(tǒng)確定最佳MOI；然而，Ad5培養(yǎng)過(guò)程的典型值范圍是每個(gè)細(xì)胞10到200個(gè)病毒顆粒，結(jié)果是放大比率>200。

可以在攪拌罐生物反應(yīng)器中培養(yǎng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的Per.C6和293細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在批量培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)，病毒生產(chǎn)的最佳細(xì)胞密度約為5×10^5細(xì)胞/mL，比可能的理論最大細(xì)胞密度低一個(gè)數(shù)量級(jí)。這被稱(chēng)為“細(xì)胞密度效應(yīng)”。細(xì)胞代謝受到營(yíng)養(yǎng)耗盡和代謝物積累的阻礙，使細(xì)胞無(wú)法在高密度下支持病毒生產(chǎn)。在感染時(shí)交換介質(zhì)可以減少細(xì)胞密度效應(yīng)，因?yàn)檫@補(bǔ)充了底物并去除了代謝物。當(dāng)使用連續(xù)培養(yǎng)模式時(shí)，密度超過(guò)5×10^6細(xì)胞/mL，規(guī)模從3到20升。通過(guò)替換至少90%的介質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)最佳病毒生產(chǎn)，每毫升1×10^6細(xì)胞。通過(guò)優(yōu)化生物反應(yīng)器中的物理化學(xué)條件可以顯著提高病毒滴度。溫度、pH值、溶解氧（DO）和部分CO2壓力（pCO2）都已被證明是細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和腺病毒生產(chǎn)的重要參數(shù)。

4.腺相關(guān)病毒

腺相關(guān)病毒（AAV）是一種小的、自然復(fù)制缺陷病毒，最初在1965年作為腺病毒的共感染因子被發(fā)現(xiàn)。為了在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，AAV需要腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒的幫助，或某種形式的基因毒性應(yīng)激。有11種不同的AAV血清型和100多種AAV變體，盡管血清型AAV6幾乎與AAV1相同，AAV10和AAV11的表征不是很好。每種血清型都有自己的特征衣殼，對(duì)某些宿主細(xì)胞受體有特殊的親和力，允許它被用來(lái)針對(duì)各種組織類(lèi)型。AAV基因組由單鏈DNA組成，大約5 kb長(zhǎng)?；蚪M缺乏病毒復(fù)制和表達(dá)自身基因組所需的基本基因。腺病毒從E1、E2a、E4和VA RNA基因提供這些功能。AAV基因組包含四個(gè)已知的開(kāi)放閱讀框（ORF），四個(gè)復(fù)制基因（rep）包含在第一個(gè)ORF中，編碼三個(gè)病毒衣殼蛋白的cap基因位于第二個(gè)ORF，第三個(gè)和第四個(gè)ORF上的亞基因組mRNA被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生組裝激活蛋白（AAP）?；蚪M的兩端都由倒置末端重復(fù)（ITR）序列所包圍，這些序列作為復(fù)制的自我啟動(dòng)結(jié)構(gòu)，并提供Rep介導(dǎo)的包裝信號(hào)。

4.1.腺相關(guān)病毒載體在基因治療中的應(yīng)用

從AAV制作載體的過(guò)程始于刪除編碼Rep和Cap蛋白的基因。這種刪除提供了大約5 kb的包裝空間，用于外來(lái)DNA。新的DNA被插入到只包含ITRs的“剝離”病毒中。ITRs包含在輔助病毒存在下復(fù)制和包裝所需的所有順式作用元素。Rep和Cap蛋白和所有必要的腺病毒輔助基因在一到兩個(gè)質(zhì)粒上表達(dá)。從質(zhì)粒上表達(dá)Ad基因消除了與野生型腺病毒共感染的需要。

4.2.腺相關(guān)病毒載體生產(chǎn)

生產(chǎn)AAV載體的三種不同生產(chǎn)系統(tǒng)。傳統(tǒng)方法利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，最常見(jiàn)的是HEK293細(xì)胞。細(xì)胞被共轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒，以等摩爾比包含rAAV載體（即，由ITRs包圍的轉(zhuǎn)基因）、rep和cap基因，以及腺病毒輔助基因E1、E2a、E4和VA RNA。存在該協(xié)議的變體，使用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，將包裝和輔助功能合并到單個(gè)質(zhì)粒上，或四質(zhì)粒系統(tǒng)將rep和cap基因分別放置在不同的質(zhì)粒上。通過(guò)添加酵母提取物（酵母素、Trypton N1或兩者）可以增強(qiáng)rAAV的生產(chǎn)，這可以增加2.8至3.4倍的生產(chǎn)產(chǎn)量。

無(wú)血清懸浮培養(yǎng)已成功用于通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)rAAV載體。研究表明，可以使用20升WAVE生物反應(yīng)器成功生產(chǎn)rAAV載體，病毒產(chǎn)量為10^14 VG/L。該系統(tǒng)可能被擴(kuò)大到100升，這對(duì)于涉及相對(duì)較低劑量的計(jì)劃和LCA2等罕見(jiàn)疾病適應(yīng)癥是足夠的。然而，對(duì)于成功的臨床計(jì)劃，特別是進(jìn)入后期臨床試驗(yàn)的，以及針對(duì)患者數(shù)量更多和/或每個(gè)患者需要更高載體劑量的疾病應(yīng)用，預(yù)計(jì)需要增加一個(gè)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)的生產(chǎn)能力，以滿(mǎn)足基因治療可能針對(duì)的不斷增加的疾病適應(yīng)癥的數(shù)量。通過(guò)增加生產(chǎn)細(xì)胞的比例可以實(shí)現(xiàn)載體滴度的增加。盡管獲得了高轉(zhuǎn)染效率和名義載體產(chǎn)量，研究表明只有5%-10%的細(xì)胞似乎能產(chǎn)生可測(cè)量水平的組裝AAV衣殼。

作為復(fù)雜瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法的替代方案，可以降低成本的是開(kāi)發(fā)穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系。這些細(xì)胞將病毒和貨物基因整合到細(xì)胞中，消除了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的需要，并消除了批次間差異。已從A549細(xì)胞和HeLa細(xì)胞開(kāi)發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系。包裝細(xì)胞包含包含cap、rep和由ITR序列包圍的轉(zhuǎn)基因盒以及可選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒。通過(guò)感染提供輔助病毒蛋白的復(fù)制能力Ad來(lái)啟動(dòng)AAV生產(chǎn)。生產(chǎn)細(xì)胞系已適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，并可在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，產(chǎn)量為每15升規(guī)模的10^4病毒顆粒/細(xì)胞，有潛力擴(kuò)大到500升。其他研究表明，可以在250升攪拌罐反應(yīng)器中從生產(chǎn)細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV，沒(méi)有預(yù)見(jiàn)到擴(kuò)大到商業(yè)規(guī)模2000升生物反應(yīng)器或更大的障礙。

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）是另一個(gè)已被成功用于生產(chǎn)rAAV載體的平臺(tái)。使用BEVS的主要優(yōu)點(diǎn)是不需要腺病毒輔助病毒。第一代BEVS需要將三桿狀病毒表達(dá)載體（BEVs）共感染S. frugiperda（Sf9）細(xì)胞，每個(gè)載體提供AAV生成的三個(gè)基本基因（rep：Bac-Rep，cap：Bac-Cap，和ITR包圍的感興趣基因：Bac-ITR-GOI）。第一代BEVS受到BEVs的遺傳不穩(wěn)定性的困擾，導(dǎo)致AAV產(chǎn)量和無(wú)法生產(chǎn)其他血清型的功能性AAV載體的能力下降。因此，它們沒(méi)有得到廣泛使用。通過(guò)開(kāi)發(fā)依賴(lài)于一個(gè)或兩個(gè)BEVs的系統(tǒng)，即One-Bac/Mono-Bac和Two-Bac，克服了這些限制。Mono-Bac系統(tǒng)要求Sf9細(xì)胞感染帶有所有三個(gè)基本AAV基因的單個(gè)BEV。這是一種與One-Bac1.0協(xié)議不同的方法，該協(xié)議利用桿狀病毒（BV）在穩(wěn)定的Sf9包裝細(xì)胞中誘導(dǎo)rep2（AAV2 rep）和capX（X = 感興趣的血清型）基因。細(xì)胞被感染帶有ITR包圍的轉(zhuǎn)基因盒的單個(gè)桿狀病毒載體。由BEV編碼的即刻-早期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1（IE-1）介導(dǎo)的表達(dá)增強(qiáng)，從整合的居民基因的擴(kuò)增和表達(dá)中誘導(dǎo)結(jié)果。One-Bac 1.0系統(tǒng)生產(chǎn)的AAV2載體顆粒的細(xì)胞特異性產(chǎn)量比Three-Bac高出十倍[139]。Two-Bac系統(tǒng)使用一個(gè)包含rep和cap表達(dá)盒的單個(gè)BEV（Bac-Rep-Cap或Bac-In-RepCap），因此現(xiàn)在只需要共感染兩個(gè)桿狀病毒。這種方法可以從懸浮培養(yǎng)的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中每細(xì)胞產(chǎn)生7×10^4純化rAAV顆粒。

5.未來(lái)方向和挑戰(zhàn)

近年來(lái)，獲批的基因療法數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，指標(biāo)表明我們將繼續(xù)看到更多產(chǎn)品成功完成臨床試驗(yàn)并上市。慢病毒和腺相關(guān)病毒是未來(lái)基因療法研究中最可行的載體選擇，因?yàn)樗鼈兊牟涣挤磻?yīng)有限且免疫原性特征良好。盡管基因療法最近取得了成功，但一些生物制造挑戰(zhàn)仍然存在。迄今為止的許多研究都集中在優(yōu)化病毒載體的設(shè)計(jì)和高效的生產(chǎn)者及包裝細(xì)胞系統(tǒng)上。未來(lái)的研究需要關(guān)注能夠有效監(jiān)控和控制影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)（CPP）的過(guò)程分析技術(shù)（PAT），從而提高最終產(chǎn)品的一致性并優(yōu)化生物過(guò)程生產(chǎn)方法。國(guó)家細(xì)胞制造聯(lián)盟（NCMC）——一個(gè)由行業(yè)、政府、臨床和學(xué)術(shù)組成的公私合營(yíng)聯(lián)盟——在2016年國(guó)家路線(xiàn)圖（以及隨后的2017年和2019年更新）中確定了多個(gè)核心挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)涵蓋了過(guò)程監(jiān)控和控制、細(xì)胞處理和自動(dòng)化、供應(yīng)鏈和運(yùn)輸物流以及勞動(dòng)力發(fā)展，必須在國(guó)家層面解決，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和基因制造的未來(lái)。在確定的核心挑戰(zhàn)中包括：（i）缺乏足夠的生物加工模型來(lái)預(yù)測(cè)制造條件和材料對(duì)細(xì)胞行為的影響；（ii）缺乏足夠的替代標(biāo)記物來(lái)理解細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）；（iii）缺乏足夠的過(guò)程分析技術(shù)（PAT）和檢測(cè)細(xì)胞特性的檢測(cè)方法。這些挑戰(zhàn)——是行業(yè)、學(xué)術(shù)和政府利益相關(guān)者確定的最關(guān)鍵研究和發(fā)展領(lǐng)域——需要在人工智能（AI）（包括機(jī)器學(xué)習(xí)理論和自動(dòng)化機(jī)器人學(xué)及控制學(xué)）、數(shù)據(jù)分析和預(yù)測(cè)建模方面具有顯著的技能。過(guò)程控制需要超越傳統(tǒng)的物理化學(xué)過(guò)程控制參數(shù)（pH、溶解O2和溫度），并納入組學(xué)、實(shí)時(shí)細(xì)胞代謝物分析以及內(nèi)源性因素、表面標(biāo)記物和基因表達(dá)的非破壞性測(cè)量。新的PAT將闡明哪些制造或過(guò)程變量可以產(chǎn)生具有適當(dāng)CQAs的一致且可復(fù)制的產(chǎn)品。這反過(guò)來(lái)，又可以導(dǎo)致基于質(zhì)量的設(shè)計(jì)（QbD）制造過(guò)程，從而提高大規(guī)模、可復(fù)制、低成本生產(chǎn)高質(zhì)量和安全基因療法的能力。