治療性寡核苷酸的純化及表征是目前制藥行業(yè)的一大熱點。然而，寡核苷酸的表征，特別是通過離子對反相液相色譜（IP-RPLC）進行表征，可能會非常具有挑戰(zhàn)性。治療性寡核苷酸是通過固相合成制造，也就是核苷酸以特定合成步驟進行循環(huán)。因此，我們必須對 n-1 和 n+1 等雜質(zhì)進行表征，這其中可能需要大量的方法開發(fā)步驟來進行優(yōu)化。此外，我們可能還需要對其他密切相關的雜質(zhì)進行表征和定量，例如硫代磷酸酯的氧化。

另一個挑戰(zhàn)是在寡核苷酸分析中可能會觀察到的色譜的變化。保留時間、峰形和峰面積回收率可能在一個序列的進樣之間變化。這些變化的一個可能原因是有會影響色譜性能的分子內(nèi)相互作用。因此，我們通常會采用超過 60°C 的高溫來改善分離。雖然這是處理雙鏈寡核苷酸（如 siRNA）時的基本要求，但單鏈寡核苷酸是否也有必要在高溫下分析是一個值得討論的問題。在此技術筆記中，我們展示了溫度對兩種寡核苷酸，一種 5‘ 共軛寡核苷酸和一種硫代磷酸酯，的影響，以及如何將其用于單鏈寡核苷酸的方法開發(fā)過程。

圖 1 說明了以 5°C 為增量增加方法運行溫度的效果。和其他色譜方法類似， 5'-氨基 C12 寡核苷酸的保留時間隨著溫度升高而減少。通常，效率和峰形在更高的溫度下會得到改善，但是在本示例中沒有觀察到這一點。此外，在比較 45°C 和 65°C 的雜質(zhì)分布時，圖中幾乎沒有顯示出明顯差異。因此，人們可能會得出結論，選擇性沒有受到溫度的影響。

為了更好地確認選擇性變化，需要使用質(zhì)譜來識別和表征雜質(zhì)峰。具有未知序列的 22 mer DNA 硫代磷酸酯通過高分辨率 MS 進行分析。硫代酸鹽的測量質(zhì)量為 6772.6 Da。我們在不同溫度下進行寡核苷酸的分析，以觀察雜質(zhì)分析選擇性的變化。

在比較 60 和 70°C 下運行的方法時（圖 2），如預期所示，在較高運行溫度下，主峰的保留顯著降低。然而，兩種方法都給出了相似的雜質(zhì)譜。我們觀察到了三種較早洗脫的雜質(zhì)。解卷積質(zhì)譜證實了相同的洗脫順序。雜質(zhì)峰1為6443.4 Da，峰2為6468.4 Da，峰3為6170.8 Da。兩種運行條件下峰 1 的解卷積光譜如圖 3 所示。有趣的是，峰 1 和 2 可能都是 n-1 雜質(zhì)，峰 1 是目標序列減去鳥苷，峰 2 是目標序列減去胸苷。

總的來說

不同溫度通常用于寡核苷酸分析的方法開發(fā)。然而，對于單鏈寡核苷酸，在超過 60 的溫度下運行可能并沒有太大提升。因為溫度的升高可能不會改善色譜分離，也不會影響選擇性，正如我們在其他大分子中觀察到的一樣。

液相色譜條件

色譜柱： bioZen™ 2.6 µm Oligo

規(guī)格： 100 x 2.1 mm （圖 1）00D-4790-AN

150 x 2.1 mm （圖 2,3）00F-4790-AN

流動相：圖1：

A：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液

B：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA甲醇溶液

圖2，3：

A：100 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液

B：100 mM HFIP, 4 mM TEA 甲醇溶液

梯度： 5-30 % B 于14分鐘內(nèi) （圖1）

25-95% B于15分鐘內(nèi)（圖2，3）

流速： 0.3 mL/min

進樣量： 1uL

溫度： 如圖所示

檢測器： UV@260nm（圖1，2）

TOF-MS（圖3）

樣品： 5‘-氨基C12 寡核苷酸（圖1）

DNA 22mer硫代磷酸酯（圖2，3）

圖1：溫度對 5'-氨基 C12 寡核苷酸的影響

圖2：22 mer DNA 硫代磷酸酯的雜質(zhì)譜圖

圖3：雜質(zhì)峰 1 的解卷積譜圖