在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體污染是一個常見且棘手的問題。支原體是一類極其微小的微生物，缺乏細(xì)胞壁，呈高度多形性，能夠在不知不覺中潛入細(xì)胞培養(yǎng)體系，對細(xì)胞的生長、形態(tài)和功能等方面產(chǎn)生諸多不良影響。因此，準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否被支原體污染至關(guān)重要，這關(guān)系到實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下將詳細(xì)介紹幾種判斷細(xì)胞是否被支原體污染的方法。

一、觀察細(xì)胞形態(tài)和生長特征

支原體污染嚴(yán)重時，可引起細(xì)胞生長減慢、培養(yǎng)基pH變酸、細(xì)胞病變等特征。通過觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長特征，可以初步判斷是否存在支原體污染。

• 細(xì)胞體積變化：支原體的寄生可能影響細(xì)胞的正常代謝和滲透壓調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞體積異常。一些細(xì)胞可能會變得腫脹，邊緣模糊不清；而另一些細(xì)胞則可能變小。

• 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則：原本應(yīng)該呈多邊形或梭形等典型形態(tài)的細(xì)胞，在支原體污染后可能會變得扭曲、變形，失去其正常的幾何形狀。

• 細(xì)胞質(zhì)顆粒增多：支原體感染可能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的顆粒狀物質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)看起來不再清澈透明。

• 生長速度異常：健康細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下具有相對穩(wěn)定的生長速度。但被支原體污染后，細(xì)胞的生長速度可能會明顯加快或減慢。

二、檢測細(xì)胞代謝產(chǎn)物

支原體的代謝活動可能會影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中某些代謝產(chǎn)物的含量。例如，支原體可能會消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致其含量下降速度加快；同時，支原體還可能產(chǎn)生一些特殊的代謝產(chǎn)物，如乳酸、氨等，使培養(yǎng)基的酸堿度發(fā)生變化。通過定期檢測培養(yǎng)基中這些物質(zhì)的含量和酸堿度變化，可以間接推斷細(xì)胞是否被支原體污染。

三、微生物學(xué)檢測方法

1. 培養(yǎng)法

將細(xì)胞培養(yǎng)上清液接種到適宜的支原體培養(yǎng)基中，在特定的溫度和氣體環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)支原體的菌落形態(tài)，如“煎蛋樣”菌落，則可以初步判斷細(xì)胞被支原體污染。然而，這種方法培養(yǎng)周期較長，通常需要數(shù)天甚至數(shù)周的時間，且靈敏度相對較低。

2. DNA熒光染色法

采用特定的熒光染料，如Hoechst 33258等，這些染料能夠與支原體的DNA特異性結(jié)合。將細(xì)胞進(jìn)行染色處理后，在熒光顯微鏡下觀察。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周圍或內(nèi)部存在著點狀或絲狀的熒光信號，就提示可能存在支原體污染。這種方法相對快速、靈敏，但也可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要結(jié)合其他方法進(jìn)行驗證。

3. PCR檢測法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是一種高效的檢測手段。通過設(shè)計針對支原體特異性基因序列的引物，對細(xì)胞樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。利用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，可以判斷是否存在支原體污染。這種方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，且檢測周期短，是目前常用的檢測方法之一。

4. 電子顯微鏡觀察

利用電子顯微鏡或免疫電鏡對樣本進(jìn)行觀察，可以直觀地看到支原體的形態(tài)和分布。這種方法準(zhǔn)確性較高，但受條件限制，且檢測時間長，敏感性不高。

四、預(yù)防措施

為了降低細(xì)胞被支原體污染的風(fēng)險，需要采取一系列預(yù)防措施：

• 嚴(yán)格遵循實驗室清潔和消毒程序，確保實驗環(huán)境的無菌狀態(tài)。

• 使用合格的器皿和耗材，避免使用有破損或污染的器皿。

• 防止空氣污染，盡量減少不必要的進(jìn)出實驗室，避免引入外來微生物。

• 嚴(yán)格控制實驗室人員的衛(wèi)生，保持良好的個人衛(wèi)生習(xí)慣。

• 定期對實驗室環(huán)境和設(shè)備進(jìn)行檢測，以確保沒有微生物滋生。

支原體污染對細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和實驗結(jié)果的可靠性構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，需要綜合運用多種方法來判斷細(xì)胞是否被支原體污染，包括觀察細(xì)胞形態(tài)和生長特征、檢測細(xì)胞代謝產(chǎn)物、微生物學(xué)檢測方法等。同時，還需要采取預(yù)防措施來降低污染風(fēng)險，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。只有這樣，才能為科學(xué)研究和臨床診斷提供堅實的技術(shù)支持。