隨著生物技術的不斷發(fā)展，轉基因植物在農業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領域的應用越來越廣泛。通過轉基因技術可以幫助科學家更好的理解植物或農作物的生物學功能驗證。然而，如何準確、快速地檢測轉基因植物中的外源基因表達和功能，一直是科學家們面臨的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的轉基因檢測方法如PCR、Southern blot、Northern blot等，雖然具有一定的準確性和可靠性，但也存在著操作復雜、耗時耗力、靈敏度低等缺點。因此，建立操作簡便、直接從目的蛋白表達量篩選高表達轉基因植株一直是植物分子生物學家要解決的技術難題。

熒光素酶報告基因技術作為一種新型的轉基因檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、實時監(jiān)測等優(yōu)點，一直是轉基因研究中的重要手段。熒光素酶是一種能夠催化熒光素氧化并產生生物發(fā)光的酶。在轉基因植物中，將熒光素酶基因與目標基因的啟動子或其他調控元件連接，構建成報告基因載體。當目標基因表達時，熒光素酶也會隨之表達。通過加入熒光素底物，可以檢測到熒光素酶產生的生物發(fā)光信號，從而間接反映目標基因的表達水平。

圖1：熒光素酶報告基因工作原理

近日，日本的研究團隊開發(fā)了一種名為Lumi-Map的高通量平臺，該平臺結合了基于孔板的熒光素酶 (LUC) 報告基因檢測和突變圖譜 (MutMap) 的技術，實現(xiàn)了對突變體的高效篩選和基因功能的快速鑒定，為我們揭示了擬南芥中參與病原體相關分子模式 (PAMP) 觸發(fā)免疫的基因。這一研究成果不僅為植物免疫機制的研究提供了新的思路，也為熒光素酶報告基因技術在轉基因植物中的應用提供了成功的范例。

圖2：Lumi-Map方法的示意圖。用甲基磺酸乙酯 (EMS) 誘變WRKY29報告菌株（W29-1-4），獲得M2后代獲得的。通過flg22處理的M2幼苗的生物發(fā)光監(jiān)測進行突變體篩選。PTI=病原體相關分子模式觸發(fā)免疫。將表現(xiàn)出突變型生物發(fā)光表型的M2幼苗繁殖到WRKY29表達改變的M3和突變體經flg22處理（awf突變體），然后在確認生物發(fā)光表型后選擇。病因基因鑒定由MutMap。將awf突變體與親本報告系（W29-1-4）雜交，自交F1后代獲得F2。F2株用flg22處理并對其生物發(fā)光表型進行監(jiān)測。對F2突變株的DNA進行全基因組測序通過MutMap分析來確定致病的單核苷酸多態(tài)性（snp）。

研究人員創(chuàng)建了9種轉基因擬南芥報告系，該報告系中包含由防御基因啟動子驅動的LUC基因。當植物受到PAMP（如flg22）處理時，啟動子被激活，從而會產生生物發(fā)光。通過篩選24,000個經甲基磺酸乙酯 (EMS) 誘導的突變體，研究人員鑒定了22個在flg22處理后WRKY29表達改變的突變體（簡稱awf突變體）。與PAMP觸發(fā)免疫相關的阿拉伯芥基因包括FLS2（鞭毛素感知受體），以及在研究中發(fā)現(xiàn)的其他三個未被之前關聯(lián)的基因。通過結合Lumi-Map和MutMap，研究者能夠快速識別出與PTI信號傳導相關的致病突變。

圖3：9個擬南芥報告系經flg22處理后的生物發(fā)光信號，轉基因擬南芥植株8天大的幼苗包含pWRKY29-LUC、pWRKY18-LUC、pWRKY28-LUC、pRBOHD-LUC、pPAL1-LUC、pPR4-LUC、pERF1-LUC、pAt1g51890-LUC、pAt2g17740-LUC用水（綠色）或0.5µM flg22（藍色）處理。實時監(jiān)測每棵幼苗的生物發(fā)光情況系統(tǒng)在時間點。數(shù)據(jù)以每次處理至少7株幼苗的平均值±標準誤差表示。

本研究中利用擬南芥的種子構建轉基因植株，

其后的Lumi-Map高通量篩選的流程如下：

1種子處理：表面消毒后的種子在4°C黑暗環(huán)境孵育2天解除休眠；

2播種：處理后的種子播至96孔微孔板，每孔加150 µl 半濃度液體MS培養(yǎng)基（含0.5%蔗糖和50 µM D-熒光素-K）；

3光照和處理：連續(xù)光照培養(yǎng)7天促發(fā)芽，發(fā)芽幼苗用 0.5 µM flg22、0.5 µM elf18或1 mg/ml幾丁質處理；

4密封：用板封密封96孔板保持濕度防蒸發(fā)；

5生物發(fā)光測量：用生物化學發(fā)光微孔板讀板儀進行批量檢測；

6數(shù)據(jù)分析：用商業(yè)化軟件 (SL00-01) 分析生物發(fā)光數(shù)據(jù)評估不同處理影響。通過這些步驟可有效測量幼苗在不同處理下的生物發(fā)光反應。

在上述案例中，Lumi-Map技術的創(chuàng)新之處在于將實時熒光素酶生物發(fā)光篩選與MutMap技術相結合，實現(xiàn)了對突變體的高效篩選和基因功能的快速鑒定。

實時監(jiān)測：Lumi-Map技術可以實時監(jiān)測熒光素酶的生物發(fā)光信號，從而快速篩選出具有特定表型的突變體。這大大縮短了研究周期，提高了研究效率。

高通量篩選：該技術可以同時對大量的突變體進行篩選，為大規(guī)?；蚬δ苎芯刻峁┝擞辛χС?。

基因定位：結合MutMap技術，可以快速確定與特定表型相關的基因位點，為進一步的基因功能研究提供了重要線索。

得益于Lumi-Map技術平臺提供的高通量檢測效率，該研究團隊在后續(xù)進行了更多植物抗病的研究，并在Science雜質上發(fā)表了研究論文，擬南芥中發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌的鞘脂的受體，揭示了植物識別病原體脂質的機制。

此外，熒光素酶報告基因在轉基因植物中還有很多其他應用：

1基因表達分析：通過監(jiān)測熒光素酶的發(fā)光強度，可以實時、定量地分析目標基因在不同組織、發(fā)育階段或環(huán)境條件下的表達情況。例如，在研究植物對逆境脅迫的響應時，可以利用熒光素酶報告基因觀察相關基因的表達變化。

2啟動子活性研究：將熒光素酶基因置于不同的啟動子下游，構建成一系列報告基因載體，轉化植物后可以分析啟動子的活性。通過比較不同啟動子驅動下熒光素酶的表達水平，可以確定啟動子的強度、組織特異性和誘導性等特性。

3蛋白質定位研究：通過將熒光素酶與目標蛋白質融合表達，可以利用熒光素酶的發(fā)光信號來確定蛋白質在細胞內的定位。例如，研究人員可以將熒光素酶與細胞膜蛋白、細胞器蛋白或核蛋白等融合，觀察其在植物細胞中的分布情況。

4信號轉導研究：熒光素酶報告基因可以用于研究植物中的信號轉導途徑。例如，在研究植物激素信號通路時，可以將熒光素酶基因與激素響應元件連接，構建成報告基因載體。當植物受到激素刺激時，信號轉導途徑被激活，熒光素酶的表達也會隨之改變。通過監(jiān)測熒光素酶的發(fā)光強度，可以實時跟蹤信號轉導的過程，揭示信號轉導的機制。

熒光素酶報告基因技術作為一種新型的轉基因檢測方法，與傳統(tǒng)的轉基因檢測方法相比，熒光素酶報告基因技術具有明顯的優(yōu)勢，

在轉基因植物的研究中具有廣泛的應用前景：

1操作簡便性：傳統(tǒng)的轉基因檢測方法，如 PCR、Southern blot、Northern blot 等，需要進行復雜的核酸提取、電泳、雜交等操作流程，既耗時又費力。而熒光素酶報告基因技術僅僅需要將報告基因載體轉化到植物中，然后加入熒光素底物即可檢測生物發(fā)光信號，操作簡便快捷

2靈敏度：熒光素酶報告基因技術具有靈敏度，能夠檢測到極低水平的基因表達。

3實時監(jiān)測：熒光素酶報告基因技術可以對基因的表達變化進行實時監(jiān)測，而傳統(tǒng)方法只能檢測某一特定時間點的基因表達情況。

4空間分辨率：通過將熒光素酶與目標蛋白質融合表達，可以利用熒光素酶的發(fā)光信號來確定蛋白質在細胞內的定位，具有較高的空間分辨率。而傳統(tǒng)方法無法提供蛋白質的定位信息。

瑞孚迪可為熒光素酶報告基因提供高通量篩選系統(tǒng)：

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超靈敏化學發(fā)光模式使每塊384孔板的檢測時間從一小時以上縮短為不到兩分鐘，不僅節(jié)省了機器運行時間，還能大幅度降低漂移效應。

EnVision系統(tǒng)還包括了其他豐富的檢測技術：

吸光度

熒光強度

熒光偏振

氙燈時間分辨熒光

激光時間分辨率熒光

Alpha，0.1nm光譜掃描等模式