Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis

Keywords: Disturbed flow; MerTK; RNA-seq; atherosclerosis; efferocytosis; proteomics.

動脈粥樣硬化是缺血性心臟病和中風最常見的潛在原因。大量證據(jù)表明，動脈分支和彎曲處的擾動流（d-flow）模式更易導致動脈粥樣硬化病變，而存在高剪切應(yīng)力的穩(wěn)定層流（s-flow）區(qū)域則可防止動脈粥樣硬化。主動脈內(nèi)皮細胞（ECs）是血管壁內(nèi)層的主要成分，直接暴露在血流中，在各種化學和機械刺激下對血管功能發(fā)揮重要作用。

MER 原癌基因酪氨酸激酶（MerTK）是 TAM（Tyro3、Axl 和 MerTK）受體家族的成員，在多種惡性腫瘤中高度表達，其在有效清除凋亡細胞中起關(guān)鍵作用，這一過程稱為胞葬作用（Efferocytosis）。晚期動脈粥樣硬化中胞葬作用受損可導致繼發(fā)性細胞壞死和壞死碎片積聚形成的壞死核心，從而引發(fā)斑塊破裂和急性血栓性心血管事件。最近研究報道了原發(fā)性主動脈 ECs 具有很高的胞葬作用能力，且在血管衰老中起重要作用。

然而，以往的研究并未顯示血流模式與 EC 胞葬作用之間的直接聯(lián)系，以及血流模式與 MerTK 表達之間的相互作用。MerTK 在 d-flow 介導的內(nèi)皮功能障礙中的作用及其對動脈粥樣硬化病理過程的影響也是未知的。因此，美國佐治亞州立大學生物學系的課題組在最近的研究中旨在解決這些未知問題，并證明了血流模式在調(diào)節(jié)MerTK 介導的主動脈內(nèi)皮細胞胞葬作用中發(fā)揮重要作用。研究成果發(fā)表在 Theranostics 期刊題為“Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis”。

MerTK 主要在巨噬細胞中表達，關(guān)于MerTK 在 ECs 中表達的研究非常有限。因此，實驗首先對健康個體及惡性白血病患者的不同類型造血細胞的表觀遺傳圖譜進行了大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)MerTK 在 CD14++CD16- 單核細胞、巨噬細胞和效應(yīng)B 細胞以及內(nèi)皮祖細胞和靜脈 ECs 中高度表達（圖1 A）。進一步大數(shù)據(jù)分析（圖1 B）顯示，MerTK 在血管（如主動脈、冠狀動脈和脛動脈）、心臟（如左心耳和左心室）和血液（如轉(zhuǎn)化的淋巴細胞和全血）中表達。

然后研究了凋亡細胞是否可以激活主動脈 ECs 中的 MerTK 表達和胞葬作用。Western blotting 顯示，凋亡的 Jurkat 細胞在原代人主動脈 ECs（HAECs）中顯著誘導 MerTK 表達（圖1 C）。免疫染色顯示，HAECs 具有很高的胞葬作用能力，可以清除凋亡的 Jurkat 細胞（圖1 D）。有趣的是，凋亡的 Jurkat 細胞以時間和劑量依賴性方式誘導 MerTK 表達（圖1 E、F），且MerTK 表達在細胞比例為 1：1 時表達最高。

為了闡明被吞噬的 Jurkat 細胞是否是 HAECs 中 MerTK 表達增加的原因，將非凋亡的 Jurkat 細胞和凋亡的 Jurkat 細胞與 HAEC 一起孵育（圖1 G）。一方面，發(fā)現(xiàn) MerTK 在 Jurkat 細胞中高表達；另一方面，發(fā)現(xiàn)凋亡的 Jurkat 細胞顯著激活 HAECs 中的 MerTK 表達。這表明凋亡的 Jurkat 細胞可部分解釋 EC MerTK 表達的增加。

為了研究 d-flow 在 HAECs 中 MerTK 表達中的作用，應(yīng)用了低振蕩剪切應(yīng)力（OSS，± 5 dynes/cm2，1Hz，1 h）和d-flow（12 ± 4 dynes/cm2，1 h）。與靜態(tài)組相比，OSS 顯著抑制 HAECs 中的胞葬作用（圖1 H）。p70 S6 激酶（p70S6K）的激活是病理生理條件下血管重塑的重要過程；真核起始因子2α（EIF2α） 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下血管內(nèi)皮細胞的凋亡激活；真核起始因子3a（EIF3A）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，其水平在晚期動脈粥樣硬化病變中升高。研究表明，與靜態(tài)相比，OSS 顯著誘導 p70S6K、EIF2α 和 EIF3A 的表達（圖1 I-K）。此外，d-flow 顯著抑制 MerTK 表達，同時誘導內(nèi)皮功能障礙，表明促炎信號表達增加，如 NLRP3 炎性小體、TNF-α 和 NF-κB（圖1 L）。一致地，OSS 顯著抑制 MerTK 表達并誘導內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為eNOS、Gas 6（MerTK 配體）和TGF-β表達的降低（圖1 M）。

圖1     ECs 中的胞葬作用和 d-flow 在 MerTK 調(diào)節(jié)中的作用。

為了進一步研究 d-flow 在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中的作用，將暴露于d-flow或靜態(tài)條件下的HAECs 進行了RNA-seq，隨后與凋亡的Jurkat細胞孵育。結(jié)果表明，d-flow 上調(diào)促炎細胞因子、細胞死亡通路和衰老通路，這些都會導致內(nèi)皮功能障礙。此外，在 d-flow和動脈粥樣硬化之間發(fā)現(xiàn)了幾種新的激活途徑，例如OMA1、SR 1078和 EIF2AK3 。還有幾種新的抑制途徑，例如 PPP1R15B、CX3CR1和 CITED2 。細胞因子和趨化因子分析顯示，d-flow 顯著抑制 CCL2、PF4和 IL-10的表達，同時誘導 IL-1β、CD40LG和 IFN-γ的表達。Z-score分析表明，d-flow 顯著激活 NF-κB 復合物、TNF 和 TLR4 通路。內(nèi)皮功能分析發(fā)現(xiàn)，d-flow 促進血管系統(tǒng)的發(fā)育、血管發(fā)生和血管生成，同時抑制心臟發(fā)育、EC 運動和 EC 遷移。

然后利用動脈粥樣硬化模型（PCL）將 AAV8-PCSK9 與高脂肪飲食（HFD）相結(jié)合（圖2 A），研究 MerTK 是否受體內(nèi)血流模式的調(diào)節(jié)。Western blotting 數(shù)據(jù)顯示，與s-flow（12 ± 4 dynes/cm2，24 h）的對照 RCA 相比，MerTK 在充滿 d-flow 的 LCA 中受到顯著抑制，表明 MerTK 對體內(nèi)血流模式敏感（圖2 B）。同樣，MerTK 在胸主動脈直段（s-flow）中的表達遠高于主動脈弓（d-flow，圖2 C）。值得注意的是，在主動脈弓中，缺乏 MerTK 的內(nèi)皮區(qū)域似乎在動脈介質(zhì)巨噬細胞中表現(xiàn)出 MerTK 表達增加，這表明與血管功能障礙相關(guān)的凋亡細胞增加。圖2 D 顯示了 WT 小鼠 LCA 中凋亡標志物 caspase-3 的免疫染色和主動脈夾層的形成，表明 PCL 可能是主動脈瘤和夾層的潛在模型。此外，RCA 中沒有斑塊形成，而 WT 和 MerTK- /- 小鼠的 LCA 中發(fā)現(xiàn)明顯的斑塊形成，與 RCA 相比，裂解的 IL-1β和 caspase-3 在有斑塊區(qū)域的 LCA 中均顯著增加（圖2 E）。

為探討體內(nèi)是否存在內(nèi)皮胞葬作用，對主動脈弓中 MerTK 和 Caspase-3 進行雙重免疫染色，發(fā)現(xiàn) WT 小鼠中MerTK 主要在內(nèi)皮中表達，并檢測到內(nèi)皮胞葬作用（圖2 F）。還研究了 WT 和 MerTK-/- 小鼠主動脈弓中內(nèi)皮功能障礙標志物的表達，數(shù)據(jù)顯示，與 WT 小鼠相比，MerTK-/- 顯著誘導 NF-kB、TLR4、vWF、VACAM-1 和 p22phox 的表達（圖2 G-J）。這些發(fā)現(xiàn)表明MerTK 對體內(nèi) d-flow 敏感，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮胞葬作用和內(nèi)皮功能障礙，提示MerTK在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的內(nèi)皮功能障礙中起關(guān)鍵作用。

圖2    WT 和 MerTK- /- 小鼠的 PCL 手術(shù)和動脈粥樣硬化模型。

最后，研究分析了 PCL 手術(shù)后 MerTK-/- 小鼠 RCA 和 LCA 的蛋白質(zhì)組學，其中包括 172 種上調(diào)蛋白和 87 種下調(diào)蛋白，前幾種蛋白變化包括 CD34、Col4a1和 Eln等。此外，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）可能在 PCL 誘導的 d-flow 與血管功能之間的相互作用中發(fā)揮重要影響，MAPKs（如MAPK1、3 和 JNK）在接受急性 d-flow 的 LCA 中被激活。有趣的是，實驗注意到有許多膠原蛋白信號參與來自激活和抑制因果網(wǎng)絡(luò)中的 LCA蛋白質(zhì)變化。與 RCA 相比，LCA 中誘導的膠原蛋白（如Col14a1、Pcolce、Col12a1、Col1a2/1、Plod2）顯著更高。LCA 與 RCA 的重疊網(wǎng)絡(luò)分析顯示了激活的通路（如膠原蛋白、AKT 和 CD34）和抑制通路（如MYC-、免疫球蛋白和其他膠原蛋白亞基）。

此外，還比較了 PCL 手術(shù)后 WT 和 MerTK-/- 小鼠 LCA 中蛋白質(zhì)組學的變化，發(fā)現(xiàn)了 52 種上調(diào)蛋白和 57 種下調(diào)蛋白。實驗發(fā)現(xiàn)，與 WT LCA 相比，MerTK -/- LCA 中多種通路時被抑制時，如免疫細胞增殖、肌動蛋白細胞骨架信號和 EIF2 信號，ASXL1 被特異性激活。ASXL1 在動脈粥樣硬化中的作用在很大程度上仍然未知，EIF2 下調(diào)促進動脈粥樣硬化，表明 ASXL1 和 EIF2 可能在血流動力學介導的 EC 胞葬作用中發(fā)揮新作用，這需要進一步驗證?；?Log2 倍變化的排名靠前的激活信號和抑制信號包括 Podip3、Klk1b22、lghg等。

粘附分子、促炎因子或抗炎因子和趨化因子在動脈粥樣硬化中起重要作用。因此，繼續(xù)研究了蛋白質(zhì)組學中 MerTK 在調(diào)節(jié)炎癥因子和趨化因子中的作用。與上述發(fā)現(xiàn)一致，與 WT 組相比，MerTK-/- 激活炎癥因子 MAP4K4，同時抑制抗炎因子（如IL-4、TGF-β 1 和 IL-10RA）和抗炎趨化因子CXCL12。與 WT LCA 相比，MerTK-/- LCA 中線粒體功能障礙激活、EIF2 信號、Eif3 和 P70s6K 信號和蛋白質(zhì)泛素化通路抑制。進一步分析了激活信號網(wǎng)絡(luò)（如JUN-jun 原癌基因、FOS-fos 原癌基因、AP-1 家族激活蛋白-1 和 HIF1α-缺氧誘導因子 1亞基α）和抑制信號網(wǎng)絡(luò)（如IL-4、IL4 受體-IL4R 和 STAT3,4 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3,4）。并基于p 值總結(jié)了相關(guān)的疾病通路，表明 MerTK-/- 可能導致感染、腦功能障礙、心功能障礙、外周動脈疾病、硬化病變和動脈閉塞。

圖3   圖形概要

數(shù)據(jù)表明，原發(fā)性人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）中MerTK 對血流模式敏感，并受到擾動流和振蕩剪切應(yīng)力的抑制。與凋亡細胞一起孵育的 HAECs 中的 RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，d-flow 促進促炎途徑和衰老途徑。蛋白質(zhì)組學和免疫染色體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，與 WT 組相比，MerTK-/- 通過上調(diào)內(nèi)皮功能障礙標志物（如IL-1β、NF-κB、TLR4、MAPK 信號、vWF、VCAM-1 和 p22phox）和線粒體功能障礙加重d-flow 區(qū)動脈粥樣硬化。有趣的是，MerTK-/- 可誘導明顯的異常內(nèi)皮增厚，伴有內(nèi)皮胞葬作用減少，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。

總之，該研究為 d-flow、MerTK 和內(nèi)皮胞葬作用之間的關(guān)系及其在動脈粥樣硬化中的影響提供了證據(jù)。值得注意的是，主動脈內(nèi)皮細胞具有很強的胞葬作用能力，在 HAECs中凋亡的Jurkat細胞可在1 小時內(nèi)被高度吞噬。此外，由于HAECs 的細胞體積較大，其胞葬作用可能比巨噬細胞更高，這為內(nèi)皮胞葬作用可能是治療動脈粥樣硬化的有前途的治療靶點提供了重要的轉(zhuǎn)化線索。

參考文獻：Wu J, Liu S, Banerjee O, Shi H, Xue B, Ding Z. Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis. Theranostics. 2024 Mar 31;14(6):2427-2441. doi: 10.7150/thno.93036. PMID: 38646649; PMCID: PMC11024847.

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