1.探針的標(biāo)記：

（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升）                        2微升

T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）       1微升

Nuclease-Free Water                                           5微升

[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）     1微升

T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升）       1微升

總體積                                                                      10微升

按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。

（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。

（4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。

（5） 標(biāo)記好的探針立即使用，zui長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

2.探針的純化：

通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

（1） 對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過夜。

（3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，zui長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。

3.EMSA膠的配制：

（1） 準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。

（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大）。

TBE buffer （10X）                                                   1毫升

重蒸水                                                                          16.2毫升

39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v）       2毫升

80% 甘油 625微升

10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate）           150微升

TEMED                                                                          10微升

（3） 按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

4.EMSA結(jié)合反應(yīng)：

（1） 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：

陰性對照反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                                 7微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                            2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                                     0微升

標(biāo)記好的探針                                                                 1微升

總體積                                                                             10微升

樣品反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                                  5微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                             2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                                     2微升

標(biāo)記好的探針                                                                  1微升

總體積                                                                              10微升