免疫酶標(biāo)技術(shù)

1）  直接法

1．標(biāo)本固定。

2．PBS洗滌2×3分鐘。

3．1％ H₂O₂（或1％ H₂O₂ 甲醇）抑制內(nèi)源性過氧化物，室溫10～20分鐘。

4．正常血清（1：10）孵育，室溫20分鐘。

5．滴加酶標(biāo)記的抗體37℃1小時或4℃過夜。

6．PBS洗滌3×3分鐘。

7．DAB＋H₂O₂顯色5～10分鐘，鏡下控制染色結(jié)果。DAB＋H₂O₂應(yīng)用前15分鐘配制。

8．充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

2）  間接法

1．標(biāo)本固定。

2．PBS洗滌2×3分鐘。

3．1％H₂O₂（或1％H₂O₂ 甲醇）抑制內(nèi)源性過氧化物，室溫10～20分鐘。

4．正常血清（1：10）孵育，室溫20分鐘。

5．滴加*抗體，37℃1小時或4℃過夜。

6．PBS洗滌3×3分鐘。

7．滴加酶標(biāo)二抗，室溫1小時。

8．PBS洗滌3×3分鐘。

9．0.04％DAB＋0.03 ％H₂O₂顯色5～10分鐘。

10．  充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

3）  PAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶抗體復(fù)合物法）

1．標(biāo)定固定后，PBS洗滌。

2．1％H₂O₂（或1％H₂O₂ 甲醇）阻斷內(nèi)源性過氧化物，室溫10～20分鐘。

3．PBS洗滌2×3分鐘。

4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室溫20分鐘。

5．滴加一抗，室溫1小時或4℃過夜。

6．PBS洗滌3×3分鐘。

7．滴加二抗，室溫30分鐘。

8．PBS洗滌3×3分鐘。

9．加PAP復(fù)合物，室溫60分鐘。

10．  PBS洗滌3×3分鐘。

11．  0.04％DAB＋0.03％ H₂O₂顯色5～10分鐘。

12．  充分水洗。

13．  蘇木精復(fù)染，封片觀察。

4）  雙PAP法

1～10同單PAP法。

11．  二次加酶標(biāo)二抗。

12．  PBS洗。

13．  二次加PAP。

14．  PBS洗。

15．  0.04％DAB＋0.03 ％H₂O₂顯色5～10分鐘。

16．  蘇木精復(fù)染核，封片，鏡檢。

5）  ABC法（卵白素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法）

1～8同PAP法

9）加ABC液，室溫60分鐘。

10）  PBS洗。

11）  0.04％DAB＋0.03％ H₂O₂顯色5～10分鐘。

12）  充分水洗。

13）  蘇木精復(fù)染核，封片，鏡檢。