細胞常見問題

1.血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？

基于多年的實驗研究，用于細胞培養(yǎng)的胎牛血清以及其它血清中可能會存在以下種類的沉淀物：：（1）纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達到1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過zui后的過濾分裝后，就會在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。（2）磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點，這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認為是微生物污染。（3）膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。

2.血清中的沉淀物對細胞培養(yǎng)有什么影響？

（1）細胞生長，我們的試驗以及經(jīng)驗表明沉淀物不會影響細胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它血清生產(chǎn)商也證明了這一點。（2）過濾，如果血清中出現(xiàn)大量的沉淀物，血清將很難過濾。一般說來，因為在血清生產(chǎn)時zui后已經(jīng)經(jīng)過100nm或者40nm的過濾處理，并且經(jīng)過了嚴格的無菌檢測，因此不推薦再過濾用于細胞培養(yǎng)的血清。在實驗室中沒有必要再過濾處理血清，在大規(guī)模的細胞培養(yǎng)中往往將血清直接加到培養(yǎng)基中一起過濾。（3）污染，磷酸鈣往往被誤認為微生物污染而引起爭端。研究者可能會在血清中觀察到一些絮狀的沉淀，因此就會比較警覺的去做無菌試驗，將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會觀察到更多的絮狀沉淀，因此就斷定血清被污染了。并且當(dāng)研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可以運動的小黑點，因此就更加確認是血清被污染了。于是，研究者就會花費更多的時間和精力來和生產(chǎn)商確認，但zui終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將血清加到瓊脂板上進行培養(yǎng)以觀察是否有細菌生長。另外，也可以進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認是否有污染。

3.如何避免血清中沉淀物的出現(xiàn)？

首先要注意正確的血清解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動血清。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：（1）熱滅活血清；（2）在37℃下培養(yǎng)血清；（3）反復(fù)凍融；（4）γ射線照射；（5）長期儲存在2-8℃；（6）在室溫下放置時間過長

4.如何去除血清中的沉淀？

如想去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝到無菌離心管中，以400g離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

6.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

7.一般客戶拿到細胞后，應(yīng)該注意什么？

客戶收到細胞先不開蓋，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后（看細胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議受收細胞時的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細胞100X，200X各一張），排除細胞本身污染的情況；收到細胞未開封，出現(xiàn)污染狀況我們負責(zé)免費發(fā)送一株細胞。

收到細胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細胞密度，如為貼壁細胞，未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時，請按細胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細胞后移回培養(yǎng)瓶。

細胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

8.怎么樣確定細胞的質(zhì)量保障問題，能否開證明？能開什么樣的證明？如果細胞出現(xiàn)問題，客戶投訴，要求再發(fā)一株細胞，價格怎么算？

收到細胞48小時內(nèi)，細胞出現(xiàn)活力狀態(tài)問題（細胞活力狀態(tài)用臺盼藍染色法鑒定細胞活力），我們受理投訴；超過48小時不超過一星期，我們收取*次細胞全款的5折后，重新發(fā)放細胞。

9.快遞細胞多久能到，是寄凍存的細胞還是復(fù)蘇好的細胞？

我們采用快遞發(fā)貨，一般外地2--3天，寄細胞前請確認當(dāng)?shù)販囟?，如果氣溫低?度的，則采用郵寄凍存細胞。

10.細胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？

（1）客戶造成細胞污染，不重發(fā)；

（2）客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

（3）非推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

（4）細胞狀態(tài)不好，未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā)；

（5）細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的，不重發(fā)；

（6）細胞收到2天內(nèi)，未告知，不重發(fā)；

（7）視具體情況而定。

11.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞

12.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活。

我們的細胞株所使用的培養(yǎng)液都是Gibco公司干粉配制的，均不含HEPES，所以我們建議您準備同樣條件的培養(yǎng)液用于細胞培養(yǎng)。Hyclone的培養(yǎng)液請慎用，尤其是Hyclone液體原裝培養(yǎng)液。

13.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

14.何謂FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。

15.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性

16.培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5CO2培養(yǎng)細胞。

17.何時須更換培養(yǎng)基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19.附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。

20.懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

21.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg(約1000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。

22.細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

23.細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

24.DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。

25.冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

26.細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。

27.應(yīng)如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

28.如果細胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

29.支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

30.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

31.偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

32.CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

33.為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。

34.各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。

35.購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建, 議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

36.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。

37.收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

38.Hoechst 33258與Hoechst 33342都能染核，二者區(qū)別是什么？

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式為C27H28N6O·3HCl·3H2O，分子量為615.99。Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式為C25H24N6O·3HCl，分子量為533.88。兩種染料都是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。但是hoechst 33342對細胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細胞時容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來說hoechst 33258用于細胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對活細胞直接進行染色。