第六章 蛋白轉膜

6.1  轉膜的定義

將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如 NC 膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理*相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。

6.2  轉移膜的選擇

    雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環(huán)節(jié)。應根據(jù)雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于 Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC） 和PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 兩種規(guī)格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜，小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。

zui 常 用 于 Western Blot 的轉移膜主要是 硝 酸 纖 維 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似,主要用于核酸雜交。

    硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）膜：NC 與蛋白質靠疏水作用結合，無需預先活化，對蛋白質的活性影響?。环翘禺愋员镜罪@色淺；價格低廉，使用方便。但結合在 NC 上的小分子蛋白質在洗滌時易丟失； NC韌性較差，易損壞。

    聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋白質親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。

膜的選擇主要根據(jù)：

膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；

不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；

如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉移膜。

6.3  轉膜步驟（以槽式濕轉為例）

1.  將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10 min。

注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。

2.  依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙 6 片，放入轉移緩沖液中平衡 10 min。如用 PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5秒鐘。

3.  裝配轉移三明治：海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。

    切記：膠放于負極面（黑色面）。

4.  將轉移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉移緩沖液，插上電極，100 V，1 h（電流約為 0.3 A）。

注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。

 5.  轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。

6.4  轉膜注意事項

1. 泡膜：轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移 buffer 浸泡 20min；

a. 凝膠若是沒在預冷的轉膜 buffer 中浸泡，就會在轉膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導致出現(xiàn)轉移條帶變形。

b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

2. 轉膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板；

3. 轉膜條件：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中進行轉膜（轉膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻）；

（具體轉膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，反之則短。）

4. 其它注意事項：

a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。

b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不*。

c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉膜效率。

                      d. 雞來源的抗體與 PVDF 和尼龍膜有較強的結合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體

6.5  轉膜后檢測（此步可以省略）

   轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的 TBST（或 PBST）中漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉膜液。轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量zui大的 1-2 條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液或硬度墨汁染色液對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的 SDS-PAGE 膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

a. 麗春紅染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。

b. 印度墨汁染色：只用于放射性標記抗體或放射性標記 A 蛋白探針的 Western 印跡過程。

印度墨汁不能和化學發(fā)光物合用，若是使用呈色反應的酶檢測法時，印度墨汁的黑色會使凝膠難于拍照。這時，可改用其他檢測方法或換用麗春紅 S。

注意：從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。