懷菊花中活性物質(zhì)的閃式提取與HPLC測定

王夏青 ¹，劉延澤²，盧付軍²，鄭秀明²，趙余慶^3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧  沈陽  110032；2.河南金鼐科技發(fā)展有限公司，河南  鄭州  450016；

3.沈陽藥科大學(xué)，遼寧  沈陽  110016）

摘要  本文采用閃式技術(shù)對懷菊花活性物質(zhì)綠原酸進(jìn)行了提取工藝的比較（超聲及藥典法）和HPLC檢測，優(yōu)選了懷菊花的閃式提取工藝。

關(guān)鍵詞  懷菊花；閃式提?。?/span>HPLC

菊花為常用傳統(tǒng)中藥，來源于菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序。其味甘苦,性涼，具有散風(fēng)清熱，平肝明目之功效。主要用于風(fēng)熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花等癥^[1]。菊花的有效成分為綠原酸和黃酮類，綠原酸已經(jīng)被證明有抗菌和抗炎作用。2005年版中國藥典采用HPLC法測定綠原酸的含量作為菊花質(zhì)量的內(nèi)控指標(biāo)^[2]。

閃式提取技術(shù)是一種利用閃式提取器對于植物軟、硬材料快速提取的新型提取技術(shù)。由于完成一次提取一般在1-3分鐘左右，比傳統(tǒng)方法更快速、簡便，故被稱之為閃式提取。其原理是依靠機(jī)械剪切力和超動(dòng)分子滲濾技術(shù)，在室溫及溶劑存在下數(shù)秒鐘內(nèi)將植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等物料破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，通過過濾達(dá)到提取的目的。閃式提取技術(shù)能夠避免植物有效成分受熱破壞，具有溶劑用量小，提取時(shí)間短，效率高等特點(diǎn)^[3]，是一種新興的中藥現(xiàn)代化提取關(guān)鍵技術(shù)。

本研究以菊花中綠原酸為檢測指標(biāo)，對懷菊花進(jìn)行傳統(tǒng)提取方法及閃式提取法的比較，并依據(jù)藥典及文獻(xiàn)方法對其中的綠原酸進(jìn)行了HPLC測定，優(yōu)選出懷菊花中綠原酸提取的*工藝。

1  實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

     綠原酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，編號(hào)：110753-200413）；懷菊花購于河南；甲醇為色譜純；磷酸為色譜純；磷酸二氫鈉為色譜純；水為雙蒸水。

1.2 儀器

閃式提取器JHBE-50S（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）；精密電子天平BS-124S(德國賽多利斯公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A（上海亞榮盛華儀器廠）；恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DB（昆山市超聲儀器有限公司）；北京創(chuàng)維液相色譜儀（UV3000紫外檢測器和色譜柱恒溫箱）；CXTH-3000色譜工作站；色譜柱Kromasil C₁₈不銹鋼柱(4.6×250mm)。

1.3 色譜條件及試樣制備

1.3.1色譜條件

流動(dòng)相為磷酸二氫鈉緩沖溶液：甲醇（70：30）（取磷酸二氫鈉15.6 g加水至1000 mL，制成0.1 mol·L^-1的溶液，加入磷酸適量，使pH值為2.7；流速為1.0 mL·min^-1；檢測波長328 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制  

取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加水制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

樣品溶液制備

1.3.3試樣制備

基金項(xiàng)目：遼寧省天然藥物現(xiàn)代分離與工業(yè)化制備工程技術(shù)研究中心（2006-19-10）

*通訊作者：： , : zyq4885

1.3.3.1回流提取法:

取本品粉末（過一號(hào)篩）精稱1 g置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，回流2h，放冷，補(bǔ)充損失的甲醇量，搖勻，濾過，濃縮至近干，殘?jiān)寐确?/span>5 mL浸漬3分鐘，棄去氯仿液，殘?jiān)鼡]去氯仿，加水適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

1.3.3.2超聲提取法

取干燥的樣品適量1 g，精密加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷,補(bǔ)充損失的甲醇量，搖勻，濾過，濃縮至近干，殘?jiān)寐确?/span>5 mL浸漬3分鐘，棄去氯仿液，殘?jiān)鼡]去氯仿，加水適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

1.3.3.3閃式提取法

考察三因素三水平，提取時(shí)間（A），A₁=1 min，A₂=2 min，A₃=3 min；提取次數(shù)（B），B₁=1次，B₂=2次，B₃=3次；液料比（C），C₁=30:1，C₂=50:1，C₃=70:1。

1.3.4線性關(guān)系考察 

精密吸取綠原酸對照品溶液0.1，0.2，0.4，1，2 μL，進(jìn)行測定。以峰面積為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)作圖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。其回歸方程為：y = 40.023x + 1.6465，r=0.9998。結(jié)果表明，綠原酸在0.1 μg～2 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積之間線性關(guān)系良好。

1.3.5精密度試驗(yàn) 

精密吸取菊花閃提9號(hào)樣品10μL 同時(shí)進(jìn)樣3次，測定含量，記錄綠原酸峰面積，計(jì)算RSD％為2.24%，表明此標(biāo)準(zhǔn)曲線具有高的精密度。

1.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 

精密吸取閃提9號(hào)樣品按0，2，4，6，8 h進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算平均值，計(jì)算RSD％為2.62%，表明此方法在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.7重現(xiàn)性試驗(yàn) 

取樣品4 g，按閃提法制備9號(hào)樣品的方法，平行制備5份供試品溶液，測定含量，記錄峰面積積分值，計(jì)算RSD％為1.52%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

1.3.8加樣回收率試驗(yàn) 

精密稱定已知含量的菊花，加入一定量的綠原酸對照品，吸取一定量，按上述條件測定峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸對照品的量，RSD％為1.67%。

2  結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

菊花閃提*工藝為料液比（30：1）提3分鐘提3次 含量1.62%

表2-1菊花不同提取方法，提取物中綠原酸的含量（%）

2.2 討論

利用閃式提取法提取懷菊花的有效成分，獲得了較高提取率的綠原酸。其含量約為回流和超聲提取法的2倍。可見閃式提取法顯示出與藥典記載方法和超聲法相比較具有多方面的優(yōu)勢。

首先，閃式提取器提取法具有提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，僅需幾分鐘，便可以達(dá)到率的快速提取，節(jié)省時(shí)間和能源，這是其它提取法無法實(shí)現(xiàn)的。

其次，傳統(tǒng)的提取方法一般需要長時(shí)間加熱提取，不利于一些熱敏性物質(zhì)的穩(wěn)定存在。而閃式提取器提取是在常溫下進(jìn)行的，對于藥材中有效成分的破壞極小，更適合于熱敏性物質(zhì)的提取。

綜上所述，閃式提取法是一種更為、節(jié)能、安全的全新的提取技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 周志祥，魏俊德. 液相色譜法測定菊花中綠原酸含量的方法改進(jìn). .時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(11)：:2221-2222

[2] 劉曉芳，馬新玉，周鋼. 中國藥典菊花綠原酸含量測定方法的探討. .新疆中醫(yī)藥，2006，,24(5)：78-79

[3] 劉延澤. 植物組織破碎提取法及閃式提取器的創(chuàng)制與實(shí)踐. 中國天然藥物，2007，5(6)：401-407.