Biolife CS10細胞凍存液

美國Biolife品牌CryoStor臨床級即用型凍存液產(chǎn)品都預(yù)先配制了USP級DMSO，這是一種滲透性冷凍保護劑，有助于減輕冰的形成造成的損害。在廣泛的細胞類型中，CryoStor配方已被證明比商業(yè)和家庭釀造的等滲和細胞外配方更有效地減少保存后的凋亡和壞死。CryoStor產(chǎn)品符合 USP<71>無菌和 USP<85>內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)，并按cGMP生產(chǎn)。CryoStor CS10預(yù)先配制了10%的DMSO，在冷凍、儲存和解凍過程中為需要10% DMSO的細胞和組織提供了安全、保護的環(huán)境。通過調(diào)節(jié)對低溫保存過程的分子生物學(xué)反應(yīng)，CryoStor提供了增強的細胞活力和功能，同時消除了血清、蛋白質(zhì)或高水平的細胞毒性制劑的需求。

產(chǎn)品特點:

• 單獨的Biolife品牌標(biāo)簽

• 預(yù)配置（10%DMSO）

• 無血清

• 無蛋白

• USP級別/高質(zhì)量組分

• cGMP 制造

• FDA 藥物主文件備案

• 無菌、內(nèi)毒素,以及細胞放行測試

產(chǎn)品規(guī)格:

產(chǎn)品參數(shù)：

Jurkat T細胞微球懸浮在的低溫培養(yǎng)基中，然后放置在2 ml 凍存管中，并在2-8℃下孵育15分鐘。然后將cryovials轉(zhuǎn)移到無LN2-程序降溫儀以-1℃/分鐘的速度冷凍保存。在達到-70℃后，將樣品轉(zhuǎn)移到LN2儲存至少24小時。樣品在條件下解凍，用CGM(1:10稀釋)重懸，在37℃和5% CO2下轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱。在NucleoCounter NC-3000成像細胞儀(ChemoMetec，丹麥)上使用Via-1盒，根據(jù)膜完整性評估立即和解凍后24小時內(nèi)的細胞存活率和計數(shù)。

圖1-Jurkat T細胞的活力是基于在解凍后24小時內(nèi)使用膜完整性測定進行評估。

圖2-使用膜完整性試驗評估了解凍后Jurkat T細胞的可見復(fù)蘇率和擴增性能。

結(jié)論：

1-解凍后立即對細胞活率和數(shù)量進行分析并不能反映冷凍保存過程成功與否。未優(yōu)化的冷凍培養(yǎng)基的不良影響可能要到解凍后的24-48小時才能檢測到，這歸因于低溫保存誘導(dǎo)的延遲性細胞死亡(DOCD)。另一方面，優(yōu)化的低溫保存介質(zhì)的加入可以防止DOCD的發(fā)生;因此，減少了變異性，更準(zhǔn)確地估計了解凍后的生存和增殖。

2-低溫貯藏前的補料時間和培養(yǎng)基的變化對低溫貯藏過程的結(jié)果有重要影響。這可能是由于一些參數(shù)，包括在冷凍前活力試驗中沒有出現(xiàn)的壓力積累，但與DOCS結(jié)合，導(dǎo)致解凍后活力和功能的顯著損失。

3-冰成核的隨機性本質(zhì)上導(dǎo)致了細胞在低溫保存過程中所承受的低溫保存誘導(dǎo)應(yīng)力的變化。因此適當(dāng)?shù)某珊藢δＰ蚑細胞的生存能力和增殖能力有顯著影響。

4-在37°C介質(zhì)中稀釋(類似于患者給藥情景)是解凍后的最佳稀釋實踐。強烈建議，為了分析目的，細胞也應(yīng)在溫暖介質(zhì)中稀釋，以盡量減少在洗滌過程中滲透細胞的腫脹和溶解。

使用方法：

1. 將待冷凍保存的細胞重懸置于懸浮液中(機械或酶法解離)

2. 對細胞進行離心

3. 去除上清液-注意:盡可能多地去除培養(yǎng)基，以減少冷凍液的稀釋。

4. 添加冷(2°-8°C) 的cryostor凍存液。細胞濃度按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方案0.5-10*106細胞/mL(可能更高)。DMSO是預(yù)先混合在cryostor凍存液中且凍存液中不含添加劑。

5-預(yù)冷凍:細胞懸液在2°-8°C下孵育約10分鐘。

6-冷凍成核:在-80°C冷凍樣品(許多protocol推薦交替使用-70°C和-80°C環(huán)境來處理樣本)。對大多數(shù)哺乳動物細胞系統(tǒng)推薦使用程序降溫儀來控制速率冷凍(-1°C/min)，如果使用冷凍裝置或異丙醇容器則應(yīng)提前容器預(yù)冷至2°-8°c，使用異丙醇容器的冷凍時間(-80°C)建議約為4小時，或不超過一夜。樣品內(nèi)的冰成核應(yīng)在大約-5°C下開始，使用可控速率冷凍機上的液氮爆裂程序設(shè)置，或在大約15-20分鐘后對冷凍液/樣品容器進行機械攪拌(輕彈或輕敲)。

7.儲存:將樣品放入儲存室，在液氮溫度下(低于-130°C)儲存樣品。樣品儲存在-80°C僅建議短期儲存(數(shù)周至數(shù)月)。

8.解凍:在37°C水浴或同類似的機械解凍裝置中快速解凍樣品，樣品融化時應(yīng)輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，直到所有可見的冰都融化。在冰凍箱中，1ml樣品的大約解凍時間為2-3分鐘。不允許樣品在冷凍溫度(0-10°C)以上加熱。冷凍瓶從浴液中取出時，摸起來應(yīng)該是涼的。不建議被動解凍。

9.立即用培養(yǎng)基或等效等滲介質(zhì)稀釋細胞/冷凍液混合物。稀釋程序可以在一個步驟中完成。稀釋介質(zhì)應(yīng)在20°C至37°C之間。建議稀釋比為1:10(樣品與介質(zhì))或更大。

10. 應(yīng)用合適的配置下種細胞。

11.將細胞放入培養(yǎng)條件或立即使用。

12.解凍后進行24小時生存能力評估。

注:為了獲得低溫保存后細胞活力的準(zhǔn)確測量，應(yīng)在解凍后24小時進行評估，并與非冷凍對照樣本進行比較。

*樣品解凍后立即使用膜完整性指標(biāo)(如臺盼藍)進行評估，以比較分析樣品細胞產(chǎn)量和存活率，這往往導(dǎo)致對細胞存活率的測量不準(zhǔn)確。

建議采用活/死熒光分析或代謝分析(MTT或alamarBlue*)更準(zhǔn)確地評估可行回收率。

CryoStor產(chǎn)品在環(huán)境溫度下運輸。收到后，保存在2°-8°C，避光，直到準(zhǔn)備使用