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疫苗專題：乳佐劑制備與理化結(jié)構(gòu)特性

隨著亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗*性抗體疫苗等各種新型疫苗的出現(xiàn)，免疫佐劑的研究越來越被人們關(guān)注，臨床應(yīng)用也越來越廣泛。這些新型疫苗雖然具有抗原性良好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐劑的使用。免疫佐劑可以先于抗原或與抗原同時(shí)使用，能夠非特異地增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，而自己本身并無抗原性。對于很多傳染病，因缺乏合適的佐劑而影響重組蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的發(fā)展。因此，對于傳染病的防控不僅是研發(fā)高效低毒的疫苗，免疫佐劑的研發(fā)也至關(guān)重要。

乳佐劑簡述

油乳型佐劑是指將一定比例的油相和水相物料通過乳化，制備成油包水（W/O）或水包油（O/W）形式的乳劑。油乳型佐劑具有促進(jìn)多種抗原產(chǎn)生高效價(jià)的抗體、使抗原連續(xù)刺激的時(shí)間相對延長、抗原接種的劑量減少、抗原接種的次數(shù)降低的優(yōu)點(diǎn)。目前市場上常見的油乳佐劑主要有弗氏佐劑、白油 Span 佐劑、MF-59、ISA 206、ISA720、佐劑－65、SAF 等，其中人用疫苗多用水包油佐劑。

研究表明，粒徑是影響納米粒在體內(nèi)運(yùn)輸和被抗原遞呈細(xì)胞吞噬的重要因素。從細(xì)胞吞噬的角度來看，小于1μm的納米粒子更容易被DC和巨噬細(xì)胞吞噬，粒徑小于1μm適合引發(fā)系統(tǒng)免疫。從粒子傳輸?shù)慕嵌葋砜?，小粒徑的納米粒(<100nm)更易通過淋巴管進(jìn)行傳輸從而提高免疫效果，但是粒徑過小納米粒會滲入到血管中，過大又會影響其在淋巴管中的傳輸速度。因此粒徑在20-50nm范圍內(nèi)的納米粒是疫苗佐劑的佳粒徑范圍。但與此同時(shí)，目前上市和處于臨床研究階段的相應(yīng)納米級乳劑佐劑(如MF59、AS01-04系列、NB001-002系列等)，其粒徑均大于160nm，使得納米級(1-100nm) 藥用制劑所具有的顆粒尺小、比表面積大、表面能高、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等優(yōu)勢無法充分發(fā)揮，同時(shí)上述佐劑亦不具有類似鋁鹽佐劑的良好蛋白抗原吸附能力，在一定程度上使疫苗的免疫保護(hù)效力及免疫持久性受到了限制。

納米免疫佐劑中的納米乳免疫佐劑，是一個(gè)由油、水、表面活性劑和助表面活性劑四部分組成、粒徑為1~100nm、液滴多為球形，大小均勻，透明或半透明、具有熱力學(xué)穩(wěn)定性和各向同性、熱壓滅菌或高速離心穩(wěn)定不分層、制備的條件溫和、可自發(fā)形成的膠體分散系統(tǒng)。

納米乳佐劑對疫苗具有以下顯著優(yōu)勢：

(1)可抵抗體液的稀釋和蛋白酶降解，從而保護(hù)抗原，增強(qiáng)藥物吸收、提高抗原的生物利用率。

(2)促進(jìn)疫苗的抗原攝取和遞呈，提高藥效。

(3)促進(jìn)機(jī)體的免疫系統(tǒng)作用。

(4)提高藥物的穩(wěn)定性。

(5)工藝簡單，易于制備與運(yùn)輸、容易保存。

因此，研制出粒徑20-50nm范圍、具有高度熱力學(xué)穩(wěn)定、且能刺激機(jī)體產(chǎn)生高強(qiáng)度的粘膜免疫應(yīng)答納米乳免疫佐劑對疫苗顯得尤為重要。

制備方案

均質(zhì)機(jī)的選擇

微射流均質(zhì)屬于高壓均質(zhì)中的一種，在生物工程、輕工化工、食品飲料等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。微射流均質(zhì)的方法在作用過程中產(chǎn)生的一系列高強(qiáng)度破壞力（湍流力、剪切力以及空穴效應(yīng)）能有效破碎較大顆粒的液滴，進(jìn)而形成較小顆粒的納米乳液，且均質(zhì)條件、表面活性劑組分和濃度的變化都影響乳液粒徑。Roberts等研究發(fā)現(xiàn)微射流均質(zhì)機(jī)所具有空腔效應(yīng)可以改變表面活性劑的結(jié)構(gòu)，降低乳液的粒徑大小，進(jìn)而提高體系的穩(wěn)定性，并適用于各類乳液。

由PSI專有技術(shù)研發(fā)的增壓器及均質(zhì)腔，通過調(diào)節(jié)恒定的均質(zhì)壓力并搭配優(yōu)秀的Y、Z型幾何結(jié)構(gòu)微米級金剛石均質(zhì)腔，能夠獲得穩(wěn)定可控的剪切力，從而對工藝流程的穩(wěn)定以及線性放大的保證起到可靠支持。高2069 bar的均質(zhì)壓力搭配低于100μm孔徑的均質(zhì)腔，其產(chǎn)出的高剪切力超過市面上絕大多數(shù)同類型儀器。低至15mL的死體積更利于用作實(shí)驗(yàn)研發(fā)、處理珍貴稀有樣品。有助于研發(fā)、生產(chǎn)過程中優(yōu)化配方以獲得大的穩(wěn)定性，延長貨架期、降低生產(chǎn)成本。

PSI包括PSI-20、PSI-40、PSI-300等從小試到生產(chǎn)多種型號，可滿足不同科研或生產(chǎn)需求。

理化表征：粒徑和Zeta電位

CDE發(fā)布《病毒預(yù)防用疫苗研發(fā)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出“如涉及佐劑或新型抗原遞呈系統(tǒng)，應(yīng)結(jié)合其與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)或特性開展必要的質(zhì)量研究，理化結(jié)構(gòu)特性如佐劑等電點(diǎn)、粒徑及其分布、與抗原的吸附率等；脂質(zhì)體包封率、粒徑等。”

（1）平均粒徑和尾端大粒子：

粒徑分布檢測經(jīng)典的表征手段，通過粒徑分布可以直觀分析出均質(zhì)機(jī)制備后的差異。從而反推配方或工藝，指引研發(fā)?；蛘咄ㄟ^粒徑檢測來確認(rèn)批間差，鑒定設(shè)備運(yùn)行狀況。

Nicomp Z3000采用DLS和PALS原理，通過對粒徑分布（高斯分布和Nicomp多峰），PI值，Chi卡方值等作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

穩(wěn)定性研究一直是制劑里面重要的一項(xiàng)，引起不穩(wěn)定的因素有很多，異常顆?；蛘哒f尾端大顆粒往往受到忽視，雖然乳佐常規(guī)平均粒徑一般在亞微米級別或者納米級別，但是微米的乳粒往往大量存在，而這些尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，不斷團(tuán)聚成大顆粒，導(dǎo)致穩(wěn)定性差，甚至出現(xiàn)破乳、油相分離等現(xiàn)象，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

AccuSizer A7000APS采用SPOS技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)針對500nm以上高濃度樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測。通過對尾端大顆粒定量分析，輕松幫助客戶找到之前一直困擾客戶的質(zhì)量問題。

（2）Zeta電位：

Zeta電位的檢測往往通過納米粒度儀進(jìn)行檢測，Zeta電位作為穩(wěn)定性的一項(xiàng)參考指標(biāo)。Zeta 電位是通過檢測粒子與液體接觸的擴(kuò)散層電荷從而反映的是整個(gè)體系的穩(wěn)定程度，一般受到PH值，溫度，特殊添加劑（如表面活性劑）等因素影響，一般認(rèn)為當(dāng)絕對值大于30mv，體系較為穩(wěn)定。

Nicomp Z3000采用ELS技術(shù)，通過頻譜分析和PALS分析進(jìn)行Zeta電位檢測。無論是針對水相還是有機(jī)相樣品，都可以輕松完成檢測，更進(jìn)一步通過Zeta電位正負(fù)值判定表面修飾，或通過pH調(diào)節(jié)來確定等電點(diǎn)IEP。

圖四 某樣品Zeta電位檢測報(bào)告

總結(jié)

奧法美嘉通過PSI微射流均質(zhì)機(jī)和PSS粒度儀的Nicomp Z3000、AccuSizer A7000APS提供從初乳均質(zhì)到粒徑分析的全套方案，為制藥企業(yè)從研發(fā)到生產(chǎn)保駕護(hù)航。

• 意大利PSI-40高壓微射流均質(zhì)機(jī)

  前處理設(shè)備在線詢價(jià)