人外周血白細(xì)胞分離液發(fā)展現(xiàn)狀發(fā)展趨向自主創(chuàng)新
人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒嚴(yán)格按照人外周血白細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min，加樣后及時(shí)放人孵箱。標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作，按說(shuō)明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周?chē)?，難以清洗*。
人外周血白細(xì)胞分離液封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽(yáng)性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)，用洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無(wú)或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過(guò)程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。合理安排人外周血白細(xì)胞分離液檢測(cè)量，以免反應(yīng)板過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)，加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干，顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑，肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。人外周血白細(xì)胞分離液加樣時(shí)保持顯色劑不外流，避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
人外周血白細(xì)胞分離液應(yīng)保證清潔，整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從而提高檢測(cè)的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。人外周血白細(xì)胞分離液僅用于科研實(shí)驗(yàn)，禁用于臨床。人外周血白細(xì)胞分離液效果很好，分離步驟如下：
1.在離心管中加入人外周血白細(xì)胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和生理鹽水，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為人外周血白細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的生理鹽水，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，此時(shí)PBMC即可用來(lái)提取RNA了。如果此時(shí)不想立即提取的話，建議你－80度保存，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)RNA容易降解,所以一般在PBMC提取出來(lái)后立即進(jìn)行RNA提取。如果因?yàn)?strong>人外周血白細(xì)胞分離液少,想積攢一批樣本后進(jìn)行提取的話,PBMC的保存應(yīng)該注意了,不然就會(huì)降解的.一般降PBMC放置-80讀保存.如果你提取用的是Trizon,此時(shí)應(yīng)將Trizon試劑一起加到PBMC中保存.RNA提出后,應(yīng)該先測(cè)一下OD值,然后再跑一下電泳,這是檢驗(yàn)RNA的純度和完整性,這是保證逆轉(zhuǎn)錄成功的前體,不然的話后面就會(huì)坐無(wú)用功了.
