ELISA法檢測腫瘤壞死因子

    腫瘤壞死因子（TNF）是由激活的單核細胞巨噬細胞受內毒素刺激后產生的一種分子量為17 000的蛋白質。其中，由巨噬細胞產生的稱TNF-α，是巨噬細胞介導細胞毒效應的細胞因子；由淋巴細胞產生的稱TNF-β。TNF在體內具有廣泛的生物學活性：可作為免疫應答中的一種中間介質，既有抗病效應，又有致病效應；可引起腫瘤的出血壞死；可刺激成纖維細胞增殖；可增加HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原的表達；可激活中性粒細胞及殺傷細胞；可促進B細胞增殖及分化、增加IL-2受體表達。肝臟是TNF的主要發(fā)源地，同時也是TNF清除的主要部位。目前，以TNF-α在臨床的意義較大，是內毒素引起肝損害的重要介質。TNF-α只有通過與靶細胞表面的膜型受體（mTNF-aR）特異結合才能發(fā)揮毒性效應，這一結合過程又

受血清中可溶性TNF-α受體（sTNF-aR）的調節(jié)和制約，而sTNF-aR可與mTNF-aR競爭結合TNF-。。臨床上常以檢測TNF-α為主。

    [檢測方法]  ELISA法

    [方法學原理]  在微孔反應板上包被抗人TNF-α單克隆抗體，待測標本和標準品中的TNF-a會與單克隆抗體結合，游離的成分被洗去，同時加入生物素化的抗人TNF-α抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素與親和素特異結合，抗人TNF抗體與結合在單克隆抗體上的人TNF-α結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有TNF-α，HRP會使無色的顯色劑呈現藍色，加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度，TNF濃度與吸光度成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中的TNF-α濃度。

    [標本準備]  靜脈血2ml，不抗凝。

    [試劑]

    1．預包被微孔反應板

    2．濃縮酶結合物

    3．酶結合物稀釋液

    4．標準品和標本稀釋液

    5．濃縮生物素化抗體

    6．IFN標準晶

    7．濃縮洗滌液

    8．顯色劑A、B

    9．終止液

    [儀器]  酶標儀或全自動酶聯免疫檢測儀。

    [檢測步驟]

    1．在微孔反應板相應孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100txl，再加生物素化抗體工作液50tzl。

    2．振蕩混勻，置20-25℃環(huán)境中溫育120min。

    3．將孔內液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    4．除空白孔外，加入酶結合物工作液100u1。

    5．振蕩混勻，置20-25℃環(huán)境中溫育30min。

    6．將孔內液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。

    7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37C環(huán)境中避光顯色10min。

    8．加入終止液50ul后，輕輕振蕩混勻。用酶標儀（450nm波長）測定各孔吸光度，與標準曲線對照，求出TNF值。

    [正常參考值]  各實驗室可根據檢測方法的不同確立正常參考值。

    [注意事項]

    1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。

    2。酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內有游離酶不能洗凈。應設定30～60s的洗滌浸泡時間。

    3．滴加試劑前應將滴瓶翻轉數次，使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。

    4．所有樣品和廢棄物都應按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應注意安全。

    5．每批樣本應同時做標準曲線。

    6．若標本OD值在標準曲線測定范圍以外，應適當稀釋后重測。

    [臨床意義]  類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、惡性腫瘤、器官移植患者血清TNF升高。

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