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基因片段表達(dá)作圖法
閱讀：919 發(fā)布時(shí)間：2010-11-24 已有許多方法，包括已商品化的試劑盒（Novatope），被用來(lái)在一個(gè)表達(dá)載體系統(tǒng)中進(jìn)行隨機(jī)的或特定的開(kāi)放閱讀框基因片段的表達(dá)。然后測(cè)定基因片段庫(kù)與特定抗體的反應(yīng)性，并進(jìn)行作圖。與抗體結(jié)合的基因片段序列特性，可以通過(guò)測(cè)序分析證實(shí)。在許多實(shí)驗(yàn)中，研究者可事先將所研究的基因片段庫(kù)克隆在表達(dá)載體中。其中的基因片段可能是不完整的cDNA片段，所有這些片段均可以通過(guò)簡(jiǎn)單的免疫化學(xué)方法鑒定其中是否存在有相關(guān)的抗原表位。如果抗體與目的抗原在免疫印跡中具有較強(qiáng)的反應(yīng)，說(shuō)明可采用同樣的方法分析任一表達(dá)的基因片段。
如果某些抗體在免疫印跡試驗(yàn)中與基因片段編碼的蛋白質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，仍然可以將此類(lèi)抗體標(biāo)記后對(duì)細(xì)菌克隆直接進(jìn)行印跡分析。例如，在直接印跡分析中，所有針對(duì)SV40大T抗原的單克隆抗體與基因片段編碼的蛋白質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，但仍然可以通過(guò)測(cè)定其與p—半乳糖苷酶的融合蛋白反應(yīng)進(jìn)行表位作圖。因此，許多容易變性的抗原表位可以用此法進(jìn)行作圖。
如果在一個(gè)表達(dá)載體中沒(méi)有建立基因片段的文庫(kù)。那么，表位作圖時(shí)建立基因文庫(kù)是首要目標(biāo)。對(duì)此建議選擇一種快速、簡(jiǎn)單、適用的方法，且不必進(jìn)一步克隆和測(cè)序；而且有機(jī)會(huì)對(duì)易變性的蛋白表位作圖，至少是部分作圖。
一個(gè)的選擇是基于PCR表達(dá)原理，因?yàn)樵O(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物在體外可有效表達(dá)，并與有關(guān)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵DNA調(diào)節(jié)原件相協(xié)調(diào)。為了檢查人類(lèi)基因性疾病，如APC和BRCA2，已廣泛使用檢測(cè)影響蛋白質(zhì)合成的截?cái)嘈酝蛔?。亦有許多，其關(guān)鍵的試劑盒也可獲得。
采用PCR產(chǎn)物表達(dá)方法可以擴(kuò)增一系列的已經(jīng)確定的基因片段，并可以進(jìn)一步利用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯試劑盒將其在體外表達(dá)。此法并不需要在原來(lái)克隆基礎(chǔ)上進(jìn)行亞克隆，因?yàn)镻CR產(chǎn)物本身可以作為轉(zhuǎn)錄和翻譯的模板在體外進(jìn)行表達(dá)。但是，這也意味著PCR過(guò)程中所產(chǎn)生的序列錯(cuò)誤將不可能在克隆過(guò)程中排除。體外翻譯過(guò)程中對(duì)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，有助于采用直接免疫沉淀法分析與抗體反應(yīng)的片段。
該方法的目的是利用PCR產(chǎn)生一系列線性DNA片段，其中包括體外轉(zhuǎn)錄所必需的啟動(dòng)子和體外翻譯過(guò)程所必需的各類(lèi)調(diào)節(jié)信號(hào)。這些DNA片段實(shí)際包括了原始基因開(kāi)放閱讀框的氨基和羧基末端重疊的基因片段序列。這些線狀DNA產(chǎn)物可以直接作為模板在體外進(jìn)行翻譯表達(dá)。利用放射性標(biāo)記的氨基酸摻入體外翻譯反應(yīng)，可以用免疫沉淀方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析。較之分析前須對(duì)每一產(chǎn)物進(jìn)行克隆的表達(dá)方法，該方法有其顯著的優(yōu)點(diǎn)。在這種方法中，蛋白質(zhì)體外翻譯所產(chǎn)生的是可溶性蛋白，而且其折疊形式是與自然狀態(tài)相一致。
蛋白質(zhì)片段的羧基末端產(chǎn)生很容易，因?yàn)?，這里不需要對(duì)蛋白的氨基末端或啟動(dòng)子元件進(jìn)行任何的修飾，5，端引物應(yīng)保證PCR產(chǎn)物含有完整的啟動(dòng)子元件。相反，3，端反義引物系列將決定蛋白質(zhì)片段新的末端。
從氨基末端產(chǎn)生一系列蛋白片段則較困難，因?yàn)楸匦璞Ａ舻鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中所涉及的5’端各類(lèi)啟動(dòng)子和翻譯信號(hào)。要保證體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以采用通用的啟動(dòng)子元件，其中含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的信號(hào)，如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，不翻譯的前導(dǎo)信號(hào)序列，Kozak序列和翻譯起始密碼子。這些通用啟動(dòng)元件可以和任何一種開(kāi)放閱讀框結(jié)合，這些PCR產(chǎn)物可用一種技術(shù)將相互末端重疊的DNA片段進(jìn)行拼接，此法也稱(chēng)為重疊延伸拼接法（splicingby overlap extension，SOE）。這種拼接反應(yīng)可以產(chǎn)生一種融合產(chǎn)物，將體外轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程所需的所有元件都包括在內(nèi)，使得轉(zhuǎn)錄和翻譯可在開(kāi)放閱讀框中選擇特定位點(diǎn)進(jìn)行（Kain et a1．1991；Burch et a1．1993；Tropak and Roder1994；FarlyandLong 1995）。
35S甲硫氨酸標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物，可以用免疫沉淀和凝膠電泳進(jìn)行分析。
對(duì)任何表位作圖的結(jié)果分析，僅選用陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白片段進(jìn)行預(yù)測(cè)。缺少與特定蛋白片段陽(yáng)性反應(yīng)，并不能說(shuō)明該表位不包括在蛋白片段內(nèi)，因?yàn)椋鞍踪|(zhì)局部的折疊可能使表位被掩蓋。雖然這是在對(duì)某些構(gòu)象依賴(lài)性表位作圖時(shí)常遇到的問(wèn)題，但在所有情況下都應(yīng)該遵守這個(gè)原則。
如果由于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達(dá)試劑盒花費(fèi)太大，或者因?yàn)槭褂猛凰厥艿较拗?，另外一種可選擇的方法是采用PCR方法將一段已知片段的開(kāi)放閱讀框克隆至一種簡(jiǎn)單的、但是能夠表達(dá)的細(xì)菌表達(dá)載體中。使用能夠使表達(dá)片段產(chǎn)生基因融合的載體，如含有谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶（GST）基因、或者p—半乳糖苷酶基因的載體。上述2種載體均能產(chǎn)生大量的融合蛋白，而且，載體中含有合適的限制性酶切位點(diǎn)。這些酶切位點(diǎn)可以在調(diào)整表達(dá)片段開(kāi)放閱讀框時(shí)，配合PCR引物序列進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)。這些融合蛋白可以直接使用表達(dá)融合蛋白的細(xì)菌進(jìn)行克隆，或者以該細(xì)菌細(xì)胞提取液進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢測(cè)。