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競爭分析作圖法操作方法
閱讀：652 發(fā)布時間：2010-11-241．試劑和溶液
PBS；PBSTween（0．05％）；PBSPBA（PBS加1％BSA），不加疊氮鈉；0．1mol／L碳酸氫鈉緩沖液，pH9．6；鏈霉親和素—過氧化物酶結(jié)合物；兔抗鼠IgG-過氧化物酶結(jié)合物；YFPl；生物素標(biāo)記ZO-1抗體；末標(biāo)記的ZO-1抗體；未標(biāo)記的XHl和XH2抗體；未標(biāo)記的對照單抗PCI0；TMB底物（50mi 50g／L儲存液，5ml 0．1mol幾醋酸鈉pH6．6，lmlH202）。
2．試驗(yàn)抗體和對照抗體的活性和滴度測定
（1）YFPl儲藏液的制備：用0．1mol／L（pH9．6），碳酸氫鈉緩沖液（或PBS）稀釋YFPl，濃度為20／Ig／ml。加入96孔板中，每孔50弘1，然后室溫2h或413過夜。
（2）用PBS-Tween洗板3次。
（3）于每孔中加入PBS-BSA200~i，室溫孵育1h。
（4）用PBS-Tween洗板2次。
（5）在另外一塊96孔板中，準(zhǔn)備一系列滴度（5個以上的不同稀釋度，均用PBS-BSA稀釋）的標(biāo)記ZO-1和未標(biāo)記ZO-1、XHl和XH2，以及對照PCiO抗體。起始濃度一般應(yīng)為10ug／ml，以下每孔用PBS-BSA作10倍稀釋。雜交瘤培養(yǎng)上清可直接使用。
（6）將每種滴度的抗體50t~l轉(zhuǎn)移到抗原包被的96孔板中，室溫孵育2h。
（7）用PBS-Tween洗板4次。
（8）所有未標(biāo)記的抗體孔中分別加入50ul辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG-結(jié)合物（用PBS-BSA作1：5000的稀釋）；另外，標(biāo)記生物素的ZO-1抗體孔中加入鏈霉親合素—過氧化物酶結(jié)合物（1：5000稀釋）。
（9）室溫孵育2h或413過夜，然后用PBS-Tween洗板4次。
（10）各孔加入50rd新鮮配制的TMB底物，置室溫孵育5～15min：直到zui高濃度的特異性抗體孔出現(xiàn)藍(lán)色。
（11）加入終止液100mmol／L硫酸溶液50ug/L。在酶標(biāo)儀450nm波長下檢測吸光度OD值。
陽性抗體應(yīng)該產(chǎn)生強(qiáng)陽性信號，具有明顯的吸光度，其OD值隨稀釋度增加而下降。該稀釋靈敏度可用于檢測特異性未標(biāo)記抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)，并可證實(shí)非常弱活性的任一稀釋度反應(yīng)。這種稀釋系列可確定用于競爭抑制實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記抗體的zui適濃度。
ELISA是用于競爭抑制實(shí)驗(yàn)的較適合方法。
3．競爭抑制實(shí)驗(yàn)
（1）如上述（1）～（4）步驟，準(zhǔn)備抗原包被96孔板。
（2）分別加入系列稀釋的未標(biāo)記抗體，置室溫2ho
（3）不需洗板，直接加入已稀釋的生物素標(biāo)記抗體ZO-1 50gl其稀釋度用上述稀釋梯度中反應(yīng)zui強(qiáng)或次強(qiáng)濃度。
（4）用PBS-Tween洗板4次。
（5）將鏈霉親合素—過氧化物酶結(jié)合物用PBS-BSA作1：5000稀釋，并加入所有的孔中。
（6）室溫孵育2h或413過夜，用PBS-Tween洗板4次。
（7）每孔加入50tzl新鮮配制的TMB底物，室溫5～15rain，直至對照抗體孔出現(xiàn)藍(lán)色。
（8）加入50t．d／孔100mM硫酸溶液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450nm波長下測吸光度OD值。
zui高濃度的未標(biāo)記ZO-1抗體與標(biāo)記的ZO-1抗體因識別共同的位點(diǎn)，其OD值顯著減低。任何濃度的PCI0抗體均不抑制信號強(qiáng)度。新的競爭性抗體XH2能抑制信號強(qiáng)度，而XHl則不抑制信號強(qiáng)度，說明XH2與ZO-1可識別空間表位上共同的位點(diǎn)，而XHl則識別不同的位點(diǎn)。
用表面胞質(zhì)共振法進(jìn)行競爭作圖效率很高（Johneetal，1993）。當(dāng)抗體溶液被泵過包被有抗原的芯片時，結(jié)合于芯片上的總物質(zhì)量被光學(xué)方法測定。在該方法中抗體無需標(biāo)記，甚至無需純化，但需特殊設(shè)備和特異性的包被芯片，故價格昂貴。