mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)品-起發(fā)生物

起發(fā)生物提供mRNA 核苷和酶原料 mRNA合成技術(shù)服務(wù)助力核酸藥物，向世界產(chǎn)品看齊。

關(guān)鍵詞  mRNA 核苷 ，mRNA核心原料，高產(chǎn)量T7酶 ，高產(chǎn)率mRNA, mRNA合成，mRNA疫苗，mRNA藥物，mRNA解決方案，mRNA定制，mRNA CRO，N1-UTP（甲基假尿苷），P-UTP，Pseudo-UTP（假尿苷）

一 mRN藥物簡(jiǎn)介

基于mRNA的治療，簡(jiǎn)單來(lái)講就是利用化學(xué)修飾后的mRNA分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，利用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自有核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，生成機(jī)體所需要的蛋白質(zhì)。上世紀(jì)90年代，mRNA藥效被初步證實(shí)，之后大量的精力投入到了mRNA藥物的研發(fā)中。

mRNA藥物開(kāi)發(fā)的主要技術(shù)門檻在于穩(wěn)定性和遞送，若相關(guān)難點(diǎn)能夠得以解決，mRNA藥物就可作為蛋白質(zhì)補(bǔ)充或替代療法治療相關(guān)疾病。尤其是隨著癌癥基因測(cè)序和抗原表位發(fā)現(xiàn)等技術(shù)的發(fā)展，mRNA藥物也可用于針對(duì)腫瘤患者的個(gè)性化治療，并具有巨大的應(yīng)用潛力。目前在mRNA腫瘤藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域進(jìn)展較快的企業(yè)主要是Moderna、BioNTech和CureVac。

二、mRNA合成過(guò)程所需原料

（一）國(guó)內(nèi)外mRNA X冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下：

1）BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通過(guò)T7RNA聚合酶對(duì)DNA進(jìn)行純化和體外轉(zhuǎn)錄。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用一步法，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。

2）mRNA-1273–Moderna

利用優(yōu)化的T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在體外合成了編碼序列優(yōu)化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷*取代。轉(zhuǎn)錄后，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）和痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）將Cap1結(jié)構(gòu)添加到5’端。通過(guò)oligodT親和純化純化mRNA，通過(guò)切向流過(guò)濾將緩沖液交換到pH為5.0的醋酸鈉中，無(wú)菌過(guò)濾，并在-20°C下冷凍，直到進(jìn)一步使用。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與，甲基假尿苷取代尿苷。

3）ARCoV-艾博生物

該mRNA在體外使用T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從質(zhì)粒ABOP-028（GENEWIZ）的線性化DNA模板中產(chǎn)生，該質(zhì)粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優(yōu)化RBD區(qū)域，并包含5’和3‘的未翻譯區(qū)域（UTR）和一條poly-a尾巴，以未修飾的NTP作為原料和T7聚合酶體外進(jìn)行mRNA的合成，使用了牛痘加帽系統(tǒng)（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)進(jìn)行加帽。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與。

（二）mRNA制備過(guò)程原料

mRNA制備過(guò)程需要用到的主要原料包括質(zhì)粒DNA模板、一系列酶（主要為7種酶）以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料：質(zhì)粒

DNA模板生產(chǎn)，主要是質(zhì)粒的生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá)，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒，即得到DNA模板。目前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟，可以自建生產(chǎn)線或者外包出去，例如輝瑞自建質(zhì)粒生產(chǎn)工廠，大部分mRNA企業(yè)外包，Moderna和國(guó)內(nèi)企業(yè)目前是外包。

制備mRNA質(zhì)粒的要求：質(zhì)粒用于制備mRNA，這類DNA本身不屬于API，DNA需要按照GMP規(guī)范進(jìn)行，GMP質(zhì)粒要求生產(chǎn)設(shè)備必須是專用的、符合GMP規(guī)范且配備潔凈間

2、mRNA體外轉(zhuǎn)錄所需原料：一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要一系列酶的參與：mRNAT7聚合酶、無(wú)機(jī)焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶。

起發(fā)生物提供全線mRNA體外轉(zhuǎn)錄原料 如下表：

2.1轉(zhuǎn)錄過(guò)程所需要的酶

RNA聚合酶體系：RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分別對(duì)T3、T7和SP6噬菌體啟動(dòng)子具有高度的特異性。將目的基因序列克隆到T7和SP6啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中，以克隆的DNA為模板體外合成相應(yīng)的RNA。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子序列，以含有T7啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以核甘酸（NTP）為底物，合成與啟動(dòng)子下游的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。

無(wú)機(jī)焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入無(wú)機(jī)焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量。無(wú)機(jī)焦磷酸酶（PPase）可催化無(wú)機(jī)焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，可以為蛋白、RNA和DNA的生物合成反應(yīng)提供動(dòng)力，促進(jìn)產(chǎn)物的生成。在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生大量的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn)，可以添加無(wú)機(jī)焦磷酸酶，可解除生成的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽對(duì)反應(yīng)體系的抑制。

RNase抑制劑【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解。少量RNase在RNA制備過(guò)程中引入，會(huì)導(dǎo)致RNA的降解，污染可能通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的槍頭、試管（離心管）和其他試劑引入。通常使用RNase抑制劑作為減少和控制此類污染物的預(yù)防措施。

RNase抑制劑能與RNaseA形成1:1復(fù)合體，抑制RNase活性，在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程需要保持mRNA的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量的生產(chǎn)。

2、轉(zhuǎn)錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發(fā)中常進(jìn)行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是豐富的RNA修飾，一般由尿苷的異構(gòu)化產(chǎn)生，mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個(gè)功能：改變密碼子、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。

3、加帽和加尾：共轉(zhuǎn)錄加帽/模板加尾，轉(zhuǎn)錄后加帽/加尾

真核生物體內(nèi)會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行加帽，即在mRNA的5’端添加一個(gè)甲基化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN結(jié)構(gòu)），從而保護(hù)mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩(wěn)定性，并且協(xié)助mRNA與核糖體的結(jié)合以促進(jìn)翻譯起始。生物體內(nèi)的帽子結(jié)構(gòu)有cap0，cap1，cap2三種形式，牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基轉(zhuǎn)移酶處理即可得到cap1帽子。

此外，5'帽子還參加mRNA前體的剪接，參與mRNA3'末端多聚腺苷酸化，保證mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定運(yùn)輸。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的穩(wěn)定性和啟動(dòng)mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時(shí)之內(nèi)對(duì)mRNA進(jìn)行加帽，效率接近100%。

在mRNA疫苗研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA穩(wěn)定表達(dá)的效率對(duì)疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率大于帽子類似物mRNA的表達(dá)效率。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性、提高翻譯起始效率、引導(dǎo)mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴，如何替代加帽酶？

一步法合成mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)摻入“帽子序列"實(shí)現(xiàn)，這種加帽技術(shù)會(huì)將加帽序列反向加在mRNA上，在反應(yīng)體系中加入5’帽類似物，可以省一個(gè)加帽酶，以及減少純化步驟，一定程度上降低成本（尤其是節(jié)省了昂貴的加帽酶成本），但相對(duì)應(yīng)地，產(chǎn)量較之兩步法（加帽酶參與）減少，因?yàn)榧用泵傅募用毙矢摺?/span>

4、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成后的產(chǎn)物可能會(huì)有DNA殘留，在疫苗開(kāi)發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。需要用DNA酶（DNAase將殘留的DNA模板進(jìn)行消除，在mRNA疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中對(duì)DNA的殘留控制非常嚴(yán)格格。

三、mRNA高品質(zhì)

3.1 修飾核苷酸/核苷酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)量控制：

• 良好品質(zhì)：產(chǎn)品純度可達(dá)99%以上，且批次間質(zhì)量穩(wěn)定；

• 無(wú)動(dòng)物源成分：合成過(guò)程中不引入動(dòng)物源成分，降低病毒污染風(fēng)險(xiǎn)；

• 無(wú)污染：每批次產(chǎn)品均通過(guò)DNA酶、RNA酶及內(nèi)毒素檢測(cè)，確保產(chǎn)品合成過(guò)程未引入外源無(wú)污染；

• 表達(dá)效率保證：產(chǎn)品經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄測(cè)試和表達(dá)測(cè)試，轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)活性優(yōu)于同類產(chǎn)品；

• 工業(yè)級(jí)產(chǎn)能：修飾核苷酸產(chǎn)能可滿足工業(yè)級(jí)應(yīng)用，滿足核酸藥物從藥物開(kāi)發(fā)到工業(yè)級(jí)生產(chǎn)的不同需求。

  起發(fā)Pseudo-UTP純度： 99.2%

Me-Pseudo-UTP純度純度99.8%

3.2 酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• mRNA合成酶系列產(chǎn)品，依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)量控制：

• 良好品質(zhì)：產(chǎn)品純度可達(dá)95%以上，質(zhì)控精度優(yōu)于國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品；

• 定量檢測(cè)：采用定量檢測(cè)方法檢測(cè)DNA酶、RNA酶殘留，精準(zhǔn)定量微量殘留；

• 雜質(zhì)控制：每批次產(chǎn)品均通過(guò)DNA酶、RNA酶殘留檢測(cè)，檢測(cè)精度可達(dá)百萬(wàn)分之一酶活單位；

• 嚴(yán)防污染：生產(chǎn)過(guò)程中不引入動(dòng)物源成分，每批次產(chǎn)品均通過(guò)HIV、HBV、HCV檢測(cè)；

• 活性保證：產(chǎn)品經(jīng)過(guò)酶活測(cè)試，酶活達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

  RNA酶抑制劑純度100%

   

  

   

  牛痘加帽酶純度99.99%

  
  

   

  T7聚合酶酶純度100%

  
  

  

   

  二氧甲基轉(zhuǎn)移酶純度99.46%