細(xì)胞計數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細(xì)胞濃度、確定細(xì)胞活力和評估細(xì)胞分離程序結(jié)果的一個組成部分。建議在細(xì)胞分離之前進行初始細(xì)胞計數(shù)；然后可以將該數(shù)字與細(xì)胞分離后的細(xì)胞計數(shù)進行比較，以計算細(xì)胞恢復(fù)率。此外，當(dāng)預(yù)期細(xì)胞活力可能會降低時，應(yīng)進行活細(xì)胞計數(shù)，例如，在處理冷凍保存的細(xì)胞或離體操作的細(xì)胞時。本文描述了如何使用3%乙酸和亞-CH3藍(lán)進行總有核細(xì)胞計數(shù)，以及如何通過臺盼藍(lán)染料排除進行活細(xì)胞計數(shù)。
 
實驗步驟和方法：
 
I部分：樣品制備
 
選項1：用3%乙酸和亞-CH3藍(lán)對總有核細(xì)胞計數(shù)進行細(xì)胞稀釋
 
使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細(xì)胞懸浮液進行適當(dāng)稀釋。為了準(zhǔn)確表示濃度，請使用至少20μL的細(xì)胞懸浮液進行稀釋。
 
示例：制備10倍稀釋液
 
在微量離心管或96孔板的孔中加入180μL的3%乙酸和亞-CH3藍(lán)?；旌霞?xì)胞懸浮液，將20μL添加到含有3%乙酸和亞-CH3藍(lán)的試管或孔中。
 
選項2：通過臺盼藍(lán)染料排除對活細(xì)胞計數(shù)進行細(xì)胞稀釋
 
確保要計數(shù)的細(xì)胞懸浮液*重新懸浮。在細(xì)胞沉降之前，將適量的細(xì)胞懸液(20-200μL)放入離心管中。加入等體積的0.4%臺盼藍(lán)并輕輕混合。將混合物在室溫(15°C–25°C)下孵育5分鐘。
 
II部分：使用血細(xì)胞計數(shù)器進行細(xì)胞計數(shù)
 
通過用70%C2H6O清潔腔室表面來制備血細(xì)胞計數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。
 
使用20μL移液器重新懸浮細(xì)胞混合物，并將10μL的染色細(xì)胞放入血細(xì)胞計室。
 
注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細(xì)作用將樣品吸入。
 
將血細(xì)胞計數(shù)器放在雙目光學(xué)顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到10倍放大倍率并聚焦在細(xì)胞上。
 
使用手動計數(shù)計數(shù)器，計算血細(xì)胞計數(shù)器四個外部正方形中的每一個中的細(xì)胞（染色的細(xì)胞核）（圖1A），包括位于底部和左側(cè)周邊的細(xì)胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖1B）。如果在第一部分中使用了3%乙酸和亞-CH3藍(lán)，則計算染色的細(xì)胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍(lán)，則計算未染色的活細(xì)胞。