Cultrex® 3-D Culture Matrix™ 低生長因子基底膜抽提物，PathClear®實(shí)驗(yàn)方案
I. 產(chǎn)品描述
3D細(xì)胞培養(yǎng)可為細(xì)胞提供必要的結(jié)構(gòu)和信號指令來定向重建組織結(jié)構(gòu)。這一類方法能夠提供體外的生理性預(yù)期模型，幫助用戶評估細(xì)胞的發(fā)育與疾病狀態(tài)。正常細(xì)胞會聚集為結(jié)構(gòu)類似其來源組織的類器官，進(jìn)而表現(xiàn)出極化的形態(tài)，細(xì)胞周期調(diào)控現(xiàn)象并表達(dá)組織特異性的蛋白1-6。

I. 產(chǎn)品描述

3D細(xì)胞培養(yǎng)可為細(xì)胞提供必要的結(jié)構(gòu)和信號指令來定向重建組織結(jié)構(gòu)。這一類方法能夠提供體外的生理性預(yù)期模型，幫助用戶評估細(xì)胞的發(fā)育與疾病狀態(tài)。正常細(xì)胞會聚集為結(jié)構(gòu)類似其來源組織的類器官，進(jìn)而表現(xiàn)出極化的形態(tài)，細(xì)胞周期調(diào)控現(xiàn)象并表達(dá)組織特異性的蛋白^1-6。當(dāng)癌癥細(xì)胞聚集為腫瘤樣結(jié)構(gòu)時，則會基于其惡性程度，表現(xiàn)出組織性結(jié)構(gòu)或細(xì)胞周期調(diào)控的缺乏，并表達(dá)出腫瘤特異性的標(biāo)記物^7-9。

為了幫助用戶發(fā)揮本技術(shù)的優(yōu)勢，我們推出了Cultrex^® 3-D Culture Matrix^™ RGF BME產(chǎn)品，這款產(chǎn)品是*基底膜抽提物產(chǎn)品，經(jīng)過3D培養(yǎng)效果驗(yàn)證，專為滿足三維培養(yǎng)研究的需求而研制，。3-D Culture Matrix^™ RGF BME能夠?yàn)榧?xì)胞提供三維生長基礎(chǔ)，幫助其在體外形成特定結(jié)構(gòu)。為了提供標(biāo)準(zhǔn)化的3D培養(yǎng)基底膜抽提物產(chǎn)品，采用一套特殊工藝來降低生長因子，并將基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)濃度控制在15 mg/ml左右，。隨后在三維培養(yǎng)條件下對本品的效能進(jìn)行了評估驗(yàn)證。

II. 規(guī)格說明

1. 濃度：14 - 16 mg/ml。

2. 來源：嚙齒類Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）腫瘤

3. 儲存緩沖液：不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基 （貨號 D5030），10 μg/ml 硫酸慶大霉素 （貨號 G1264）

III. 未隨附的必要試劑與儀器

1. 設(shè)備

1. 層流罩

2. 37 °C CO₂ 培養(yǎng)箱

3. 用于收集細(xì)胞的低速旋轉(zhuǎn)4 °C離心機(jī)與離心管

4. 計數(shù)器或用于細(xì)胞計數(shù)的其它設(shè)備

5. -20 °C儲存設(shè)備

6. 冰桶

7. 移液器與吸管輔助器

8. 帶有4X物鏡與數(shù)字?jǐn)z像機(jī)的明場顯微鏡

2. 試劑

1. 感興趣的細(xì)胞系

2. 細(xì)胞收集緩沖液；EDTA，胰蛋白酶，或其他細(xì)胞解離緩沖液

3. 組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基

4. 培養(yǎng)基中可能需要添加的藥理學(xué)試劑

5. 用于潤洗細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液 （貨號 P5493）

6. 固定用福爾馬林 （貨號 F5554）

3. 耗材

1. Greiner培養(yǎng)瓶, TC處理，25 cm² （貨號 C6231）或75 cm² （貨號 C7106）規(guī)格

2. Sigma^® 離心管， 10 ml（貨號 SIAL0790）與50 ml（貨號 SIAL0828）規(guī)格

3. Sigma^® 血清學(xué)移液器，1，5和10 ml（貨號 SIAL1485， SIAL1487， SIAL1488）規(guī)格

4. 手套

IV. 注意事項(xiàng)與使用限制

1. 僅用于研究用途，不適用于診斷操作流程。

2. 這些產(chǎn)品的物理、化學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)可能尚未經(jīng)過充分研究；因此，我們建議用戶在使用這些化學(xué)試劑的過程中佩戴手套、實(shí)驗(yàn)服和護(hù)目鏡。

V. 材料鑒定

1. 功能檢測

1. 小管形成分析 - BME可促進(jìn)人（HBMVEC、HUVEC）或小鼠（SVEC4-10）內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。

2. 3D培養(yǎng) - 基底膜抽提物可促進(jìn)乳腺（MCF-10A）或前列腺（PC-3）源人上皮細(xì)胞系的分化，進(jìn)而形成腺泡結(jié)構(gòu)。

2. 無菌檢測

1. PathClear^® –PCR檢測顯示支原體陰性；小鼠抗體生產(chǎn)（MAP）檢測通常涵蓋了17種細(xì)菌和病毒株檢測，以及包括LDEV在內(nèi)的13個附加鼠類感染源檢測項(xiàng)目，合計檢測31個物種/病毒。

2. 根據(jù)USP無菌測試流程，在37 °C下孵育14天，未檢測到細(xì)菌或病毒生長現(xiàn)象。

3. LAL分析結(jié)果顯示內(nèi)毒素濃度≤8 EU/ml

3. 膠凝作用分析

1. 在37 ?°C條件下，BME會在30分鐘之內(nèi)形成凝膠，并能在37 ?C下的培養(yǎng)基中至少維持14天凝膠狀態(tài)。

VI. 儲存與穩(wěn)定性

于–20 ?C的手動除霜冰箱條件下保存時，產(chǎn)品可在發(fā)貨后三月內(nèi)保持穩(wěn)定。如需獲得更好的穩(wěn)定性，請于–80 ?C條件下儲藏。請避免反復(fù)凍融。

VII.3D培養(yǎng)方案

本方案需在層流柜或無菌室等潔凈環(huán)境下進(jìn)行，用戶需使用無菌技術(shù)以避免污染。本實(shí)驗(yàn)方案基于Debnath 等的方法¹ 。該方法是經(jīng)過充分驗(yàn)證的實(shí)例；不同的細(xì)胞系需要不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件和孵育時長。

1. 按照細(xì)胞供應(yīng)商的建議培養(yǎng)細(xì)胞，以便在37 ?C的CO₂ 培養(yǎng)箱中形成穩(wěn)定的細(xì)胞群；生長培養(yǎng)基，生長因子、血清要求和培養(yǎng)時長可能隨細(xì)胞類型而變化；此處以MCF-10A（DMEM，5%馬血清（HS），20 ng/ml hEGF，500 ng/ml qing hua ke di song，100 ng/ml霍亂毒素，10 μg/ml胰島素，1X青霉素/鏈霉素)與PC-3（RPMI-1640，10% HS，5%胎牛血清（FBS）為例。

2. 請在2-8 ?C條件下過夜解凍3-D Culture Matrix^™ RGF BME。

3. 在冰上進(jìn)行操作，向無菌48孔板的每個反應(yīng)孔中加入250 μl 3-D Culture Matrix^™ RGF BME，在37 ?C條件下孵育平板30分鐘以促進(jìn)基質(zhì)凝膠化。

4. 在冰上進(jìn)行操作，向無菌的培養(yǎng)容器中加入98 ml生長培養(yǎng)基（按照細(xì)胞供應(yīng)商推薦的方法）與2 ml 3-D Culture Matrix^™ RGF BME（終濃度為2%），并在容器上標(biāo)記“Assay Media（分析培養(yǎng)基）"，然后旋轉(zhuǎn)混勻。未用的3-D Culture Matrix^™ RGF BME可在4 ?C條件下儲存一周，或在-20°C手動除霜冰箱中（按工作用量）分裝保存。

5. 制備細(xì)胞稀釋液之前，在37?C條件下孵育Assay Media（分析培養(yǎng)基）30分鐘。

6. 從培養(yǎng)物中采集細(xì)胞，并使用24 ml分析培養(yǎng)基將這些細(xì)胞稀釋至1 x 10⁴ 細(xì)胞/ml。

7. 向含有3-D Culture Matrix^™ RGF BME的48孔板中加入細(xì)胞懸液，每孔500 μl。

8. CO₂ 培養(yǎng)箱中，37 ?C條件下過夜孵育平板。

9. 每天通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長與結(jié)構(gòu)形成情況，之后重新將48孔板放置于CO₂ 培養(yǎng)箱中37 ?C孵育過夜。

10. 在第4天，用無菌的血清移液器小心吸去原培養(yǎng)基，并更換全新的Assay Media。在第8天和第12天重復(fù)此操作。

11. 當(dāng)團(tuán)塊結(jié)構(gòu)生長至所需的大小后，制備分析用細(xì)胞（按照生產(chǎn)商的建議），并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。這一采樣時間點(diǎn)取決于所用的細(xì)胞系和生長條件。根據(jù)我們的標(biāo)準(zhǔn)，MCF-10A細(xì)胞應(yīng)在第16天進(jìn)行分析，PC-3細(xì)胞應(yīng)該10-12天時進(jìn)行分析。

分析建議

1. 固定細(xì)胞時，在含2%福爾馬林的1X PBS中室溫孵育20分鐘。

2. 可在含有BME的平板中分析細(xì)胞；也可將其（非常小心地）轉(zhuǎn)移至顯微鏡玻片上；或使用石蠟對樣本進(jìn)行包埋和切片。

圖1. 三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在3-D Culture Matrix^™ RGF BME中培養(yǎng)16天后，對MCF-10A細(xì)胞進(jìn)行染色：A）細(xì)胞染色試劑盒（結(jié)構(gòu)）；B）SYBR^®Green（細(xì)胞核）；C）MitoShift^™（線粒體膜電位）； 3-D Culture Matrix^™ RGF BME中培養(yǎng)12天后，對PC-3細(xì)胞進(jìn)行染色：D）Calcein AM（細(xì)胞活力）；E）CPA染料1（細(xì)胞核）；F）Depsipher^™（線粒體膜電位）

法律信息

3-D Culture Matrix is a trademark of Trevigen, Inc.

Cultrex and PathClear are registered trademarks of Trevigen, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Eugene OR

Depsipher and MitoShift are trademarks of Trevigen, Inc.

材料

參考文獻(xiàn)

1. Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. 2003. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. Jul; 30(3):256-68.

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