高致病性豬藍耳病病毒核酸熒光PCR檢測試劑盒
前言
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，是針對豬藍耳病毒設計的檢測體系，用于豬血清和組織等樣本的檢測。
試劑盒組成成分
組成成份（48Tests/kit） | 規(guī)格 |
核酸擴增試劑 |
|
RT-PCR反應液 | 994.5µl×1管 |
Taq酶(5U/µl) | 15.5µl×1管 |
Enhancer | 10.5µl×1管 |
對照品 |
|
陰性對照 | 25µl×1管 |
陽性對照 | 25µl×1管 |
儲存條件及有效期
本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個月。
適用儀器(熒光PCR檢測儀)
Ø ABI公司Prism7000、7300、7500系列
Ø RotorGene系列
Ø Bio-Rad公司的iCycler系列
【自備試劑】
核酸提取試劑。
【樣本采集、存放及運輸】
1．樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集。
2．存放：分離后的血清或血漿樣本在2℃—8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（多凍融3次）。
3．運輸：采用冰hu或泡沫箱加冰密封進行運輸。
【檢驗方法】
1．樣本處理（樣本處理區(qū)）：
用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存與-20℃（-80℃更佳）以待檢測。說明：陽性對照及陰性對照無需提取，直接上樣。
2．擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)）：
從試劑盒中取出RT-PCR 反應液、Taq酶及PCR Enhancer，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10秒。設所需要的PCR反應管管數為n（n = 樣本數 + 1管陰性對照 + 1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
試劑 | RT-PCR反應液 | Taq酶 | PCR enchancer |
用量 | 19.5 µl | 0.3ul | 0.2 µl |
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10秒，向設定的n個PCR反應管中分別加入20 µl，轉移至樣本處理區(qū)。
3．加樣（樣本處理區(qū)）：
向所設定的n個PCR 反應管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5µl，蓋緊管蓋，轉移至檢測區(qū)。將PCR反應管排好放入PCR儀內，記錄樣本擺放順序。
4．PCR擴增（檢測區(qū)）
4.1 循環(huán)條件設置
50℃：30 min；
95℃：3 min；
95℃：10 sec, 60℃: 1min 40個循環(huán)。
熒光信號收集設在60℃。反應體系設為25ul。
4.2 儀器檢測通道選擇
待測熒光為FAM熒光素，熒光PCR檢測儀熒光信號收集設定為FAM熒光素。
5．結果分析條件設定：
5.1 閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線（無規(guī)則的噪音線）的高點為準。
5.2 基線（baseline）應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（循環(huán)數）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（循環(huán)數）應比早出現指數擴增的樣本Ct值減少1-2個循環(huán)。
注：具體設置方法請參照各儀器使用說明書。
6．質控標準：
陰性對照的檢測結果應為陰性；
陽性對照的Ct值應小于等于32.0。
1．結果判斷：
Ø Ct值無讀數的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴格分區(qū)操作：
*區(qū)：PCR前準備區(qū)——準備擴增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū)——PCR擴增檢測。
4. 各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本區(qū)。
8. 加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
9. 擴增完畢立即取出反應管，密封在塑料袋內，丟棄于地點。
10. 反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。
1．結果判斷：
Ø Ct值無讀數的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴格分區(qū)操作：
*區(qū)：PCR前準備區(qū)——準備擴增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū)——PCR擴增檢測。
4. 各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本區(qū)。
8. 加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
9. 擴增完畢立即取出反應管，密封在塑料袋內，丟棄于地點。
10. 反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
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