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*章 基因克隆
1. 操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體
連接，取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆鑒
定（酶切法或PCR）——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆
信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存
*章 基因克隆

2. 方法

2.1 設(shè)計引物
引物設(shè)計要求：引物長度為25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm
為70℃（±4℃），且兩條引物的Tm 相差不超過4℃。引物之間及引物本身避免形
成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板不能有任何錯配。
forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC
reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC
2.2 PCR
2.2.1 PCR 反應(yīng)體系
模扳（100ng/ul 質(zhì)粒） 2.00μl
4dNTP（10mM） 1.00μl
10×PCR Buffer 5.00μl
MgCl2（25mM） 5.00μl
5’Primer （10-12uM） 4.00μl
3’Primer （10-12uM） 4.00μl
5M 甜菜堿 10.00μl
Pfu （5U/ul） 0.50μl
ddH20 18.50μl
*章 基因克隆
總計 50.00μl
2.2.2 PCR 反應(yīng)程序
1）從cDNA 文庫克隆基因
Stage1 Stage2 Stage3
1 Cycle 30Cycle 1 Cycle
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃
2min 30sec 30 sec
Xmin（2
min/Kb）
10min 1min
注：Pfu 酶zui適延伸溫度為68℃。
2）從含目的基因質(zhì)粒中克隆
Stage1 Stage2 Stage3
1 Cycle 22Cycle 1 Cycle
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃
2min 30sec 30 sec
Xmin（2
min/Kb）
10min 1min
2.3 割膠回收目的片段
（QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit）
1） 1%Agarose 膠電泳將目的DNA 片段用干凈的手術(shù)刀割下，放入1.5ml 離心管
2） 稱重后，在1.5ml 離心管中加入3 倍膠體積的buffer QG（100mg 加300ul）
3） 50℃水浴中放置10min（至膠*溶解），每2-3 分鐘混勻一次（溶膠液應(yīng)于
buffer QG 顏色相同）
4） 加入1 倍膠體積的異丙醇然后充分混勻，靜置片刻。
5） 將樣品轉(zhuǎn)移入柱子中（柱子的zui大容量為800uL），然后13000rpm*1min 離心
6） 取下柱子，棄流出液，將柱子放回到剛才那個收集管中
*章 基因克隆
7） 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室溫放置2-5min，然后13000rpm*1min 離心
8） 取下柱子，棄流出液，再次13000rpm*1min 離心
9） 將柱子放置在一支新的1.5mL 離心管中，加入50uL EB buffer （或無菌H2O）
至膜中央，靜置片刻，然后13000rpm*1min 離心，然后測定濃度
2.4 連 接
在連接反應(yīng)中通常要求： （目的基因分子數(shù)：載體分子數(shù)=3：1）
連接反應(yīng)體系
sample + -
10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl
PGEM-T （50ng/ul） 1.00μl 1.00μl 1.00μl
目的基因（150ng/ul） 1.00μl 1.00μl /
T4 連接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl
補(bǔ)水 6.50μl 6.50μl 7.50μl
于16℃連接過夜?；蚴覝兀?5℃）1 小時以上。
2.5 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化
2.5.1 CaCl2 制備感受態(tài)細(xì)胞（DH5α 、DH10B、*0 ）
1） 接過夜菌 在15ml 試管中加入3ml LB 培養(yǎng)基，從平板上挑取一單克隆接
種，37℃，260rpm，培養(yǎng)過夜，約16 小時。
2） 接菌 取2ml 過夜菌接入200ml 新鮮的LB 培養(yǎng)基， 37℃，260rpm，培
養(yǎng)，直至OD600=0.4-0.5（一般約2 小時）,然后將菌液冰浴30-60 分鐘。
3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，棄上清。
4） CaCl2 懸浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸
浮，冰浴10min。
5）離心 4℃，5000rpm×5min，棄上清。
*章 基因克隆
6）CaCl2 懸浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min 即感
受態(tài)制備完成。
此時感受態(tài)可直接使用或冰浴過夜第二天使用或加入10%的滅菌甘油，混勻后
-80℃凍存，以后使用（一般可存1 個月）。
注： 制備感受態(tài)細(xì)胞要求嚴(yán)格控制溫度，制備過程在冰上操作。
2.5.2 轉(zhuǎn)化（PGEM-T vector）
1） 準(zhǔn)備1.5ml 的離心管，冰浴預(yù)冷。
2） 取100ul 感受態(tài)細(xì)胞，加入5ul 連接液，冰浴45-60min。
3） 42℃熱刺激90sec。（此關(guān)鍵步驟，一定注意溫度及時間）
4） 冰浴2min。
5） 加LB 培養(yǎng)基900ul，37℃，150rpm 培養(yǎng)45-60min。
6） 4000rpm×3min 離心。
7） 留100ul 上清，棄多余部分，混勻，涂布到含氨芐青霉素的LB 板（預(yù)先涂
布X-gal 和IPTG）。
8） 37℃ 培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，約16 小時。
2.6 接菌
1） 轉(zhuǎn)化得到藍(lán)白菌落篩選板 （因為我們一般用的是PGEM-T 做連接，經(jīng)X-gal
處理后，有插入片段的顯白色；載體自連的顯藍(lán)色，因此得到篩選。）
2） 挑取白色的菌落接到含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基。
3） 37℃，260rpm 培養(yǎng)。
4） 培養(yǎng)5-6 小時后挑取2ul 菌液為模板做PCR 鑒定。
5） 以PCR 結(jié)果，將有目的片段插入的樣品以5ml LB 培養(yǎng)基再次接菌，37℃，
260rpm 培養(yǎng)過夜，約16 小時。
2.7 陽性克隆鑒定 （PCR 鑒定）
2.7.1PCR 鑒定體系
*章 基因克隆
10X Taq buffer 3 ul
4X dNTP （10mM） 0.5 ul
Taq DNA polymerase（5U/ul） 0.2ul（1U）
10uM引物 （雙向） 各1ul
50%DMSO（which is optional） 1ul
模板：過夜菌液 / 挑單克隆 2ul
加滅菌水至 30ul
2.7.2 PCR 鑒定程序：
94℃ 5min
94℃ 30s
30cycle 55℃ 30s
72℃ 3min
72℃ 10min
4℃ +∞
30ul 上樣，走電泳（以100bp plus marker 為對照）→核對片斷大小
2.8 質(zhì)粒抽提 （質(zhì)粒小量抽提試劑盒）
1） 收菌 以10000 rpm ×1 min 離心收菌。（一般抽提一份用3-4ml 菌液）
2） 棄上清。
3） 加100ul 冰浴Solution I（含Rnase A），渦旋振蕩，使菌體充分懸浮。
4） 加200ul Solution II，溫和混勻6 次。（此過程不超過5min）
5） 加280ul Solution III，溫和混勻6 次。
6） 以14000 rpm×10 min 離心。
7） 取上清，過吸附柱，以10000 rpm×1 min，棄濾液。
8） 吸附柱內(nèi)加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，棄濾液。
9） 反復(fù)步驟8）一次。
*章 基因克隆
10） 14000 rpm×1 min 離心。
11） 將吸附柱旋轉(zhuǎn)180 度后再14000 rpm×1 min 離心。
12） 加40ul 50℃預(yù)熱的ddH2O（或EB buffer）于吸附柱的膜中央，室溫靜置
2min。
13） 14000 rpm×1 min 離心并收集洗脫液，即質(zhì)粒DNA。
2.9 測 序
1） ABI377 測序儀測序。
2） 測序結(jié)果分析：用軟件Vector NTI Suite 6 分析測序結(jié)果。每個克隆相應(yīng)的測
序結(jié)果，分析結(jié)果，存儲信息分類輸入數(shù)據(jù)庫http://192.168.0.2/index.htm。
克隆信息管理系統(tǒng)。將測序完成的克隆編號入庫。
3. 基因克隆的編碼
根據(jù)實驗基因引物的號碼相對應(yīng)編制。
如：基因引物編號： 1000_f 1000_r
克隆編號： 1000A1 or 100092
（注：號碼倒數(shù)第二位為日期編號： 1—9 為阿拉伯?dāng)?shù)字 10=A,11=B,12=C…
zui后一位為克隆數(shù)編號，一般為1—3）