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一、目的

了解多聚合酶鏈反應(yīng)DNA 擴(kuò)增技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，掌握PCR反應(yīng)基本技術(shù)。

二、原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1986 年由Kallis Mullis發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機(jī)制探查，法醫(yī)鑒定等方面。 PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科的研究發(fā)展。

PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA段的體外方法，由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的DNA 得以迅速擴(kuò)增，主要過(guò)程如圖6。置待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈DNA模板；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3'端開(kāi)始摻入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新鏈。由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR 產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)25—30次周期之后，理論上可增加109倍，實(shí)際上可增加107倍。

PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對(duì)原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核苷酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核苷酸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，不過(guò)Innis M·A 發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會(huì)擴(kuò)大。

 

原理示意圖

PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過(guò)下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。

1、模板：?jiǎn)?、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得取*條cDNA。雖然PCR可以?xún)H用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級(jí)的克隆DNA，ug級(jí)的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。

2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC含量類(lèi)似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2 ）避免具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。

（3 ）防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

（4）引物的長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，較長(zhǎng)引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

（5）引物濃度不宜偏高，過(guò)高易形成二聚體，而且擴(kuò)增微量靶目標(biāo)或起始材料是粗制品，容易產(chǎn)生非特異產(chǎn)物。
3、緩沖液：PCR緩沖液的變化通常會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果，特別是MgCl2，其濃度對(duì)專(zhuān)一性和擴(kuò)增量有重大影響，通常zui適濃度為1.5mM左右（每種dNTP的濃度為0.2mM時(shí)），濃度過(guò)高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過(guò)低，使產(chǎn)物產(chǎn)量降低。四種dNTP濃度通常每種都是0.05mM—0.2mM。過(guò)高的濃度會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入，濃度過(guò)低，則影響反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。四種dNTP濃度應(yīng)大體相同，其中一種若偏高，會(huì)誘發(fā)錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止延伸反應(yīng)。另外dNTP能與Mg 2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低，所以如果dNTP的濃度有很大改變，MgCl2濃度也要改變。Taq聚合酶是一種耐高溫聚合酶，用量通常是1—4 單位/100ul，濃度過(guò)高，產(chǎn)生過(guò)多的非特異片段。

4、循環(huán)參數(shù)：PCR 循環(huán)是把起始材料加熱到90—95℃，保持短時(shí)間使雙鏈DNA解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退火；再升溫至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下?lián)饺雴魏塑账?，使引物沿模板延伸。解鏈?是導(dǎo)致PCR失敗的zui主要原因。用DNA擴(kuò)增儀時(shí)，94℃保持1分鐘可使模板的起始物*變性。若用低于94℃的條件，則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。引物與模板退火溫度由引物的長(zhǎng)度及G+C含量決定。適時(shí)間退火（1—2）分鐘有利于產(chǎn)物的特異性。引物延伸在70—75℃保溫的時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增DNA段的長(zhǎng)短來(lái)調(diào)節(jié)。正常情況下，每分鐘可延伸1Kb的長(zhǎng)度，常規(guī)PCR 一般為25—40 個(gè)循環(huán)，若循環(huán)加長(zhǎng)，則由于酶活性降低，聚合時(shí)間延長(zhǎng)，引物及單核苷酸減少等原因，反應(yīng)后期容易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，所以在滿足產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少周期次數(shù)。

三、材料

（一）儀器與器皿

PRC 擴(kuò)增儀（PE2400），瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性指形管，凝膠成像儀,玻片

（二）試劑與材料

1．瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0  0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2．TaqDNA 多聚酶

3．5′反應(yīng)緩沖液：125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/mlgelatin；125mmol/L（NH4）2SO4； Formamide 25%

4．混合dNTP 液（dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L）

5．DNA 模板（每2′ ml 中含有10fg 待擴(kuò)增DNA）

6．引物 1 （25pmol/L），5’加入EcoRI 粘性末端堿基

7. 引物 2 （25pmol/L），5’加入HindIII 粘性末端堿基

8. 無(wú)菌水

四．實(shí)驗(yàn)步驟

1.按順序在200ml 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購(gòu)入的試劑批次不同，加樣時(shí)有

所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。）

1） ddH2O        74ml

2） 10′Buffer    10ml

3） MgCl2         6ml（10′Buffer 如已加入MgCl2，則不必加）

4） dNTP          2ml

5） 引物1          2ml

6） 引物2          2ml

7） 模板            2ml

8） TaqDNA聚合酶2ml

總體積共100ml（也可以配成40ml 的反應(yīng)體系）

2. 在PCR 擴(kuò)增儀上按以下反應(yīng)條件編入程序：（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA段不同，各類(lèi)PCR擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過(guò)程視擴(kuò)增的DNA 片段的要求及儀器而定參數(shù)，見(jiàn)示范。）

1．預(yù)變性            94℃         2 分種

2．循環(huán)條件（30 次）

變性                  94℃        40 秒

復(fù)性                  55℃        35 秒

延伸                  72℃        2 分10 秒

3．延長(zhǎng)延伸 72℃ 7 分鐘編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開(kāi)動(dòng)機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開(kāi)始。

4. PCR 擴(kuò)增完畢，配2%瓊脂糖凝膠，取15ml 反應(yīng)液及相適應(yīng)的PCR mark 分別點(diǎn)樣，加樣緩沖液應(yīng)為40%W/V 蔗糖，電泳觀察結(jié)果。

5. 凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的 DNA 段