站在共聚焦成像與雙光子顯微術的zui高水平上

        尼康的A1R MP 是一款擁有獨到技術的雙光子顯微成像系統(tǒng)，不僅具備高分辨率檢流計式掃描器（galvanometer scanner），而且還配備了高速共振式掃描器（resonant scanner）。掃描速率在512 X 512像素水平下高達到30幀/秒；在帶狀掃描模式下zui高可達420幀/秒。新型四通道NDD探測器（non-descanned detectors）具有更高的探測效率、更低的暗電流以及更寬的響應光譜，可以對譜線相近的熒光探針進行實時光譜拆分與識別，并大大提高熒光圖像的對比度。此功能對于雙光子顯微鏡非常重要，因為在雙光子成像時一般只能使用單一的激發(fā)波長，往往不可避免地造成自發(fā)熒光以及發(fā)射光譜的重疊。

 New   新型A1R MP+掃描頭與新型正置反射GaAsP NDD，現已銷售。可使用1300nm紅外激光，提供*更深層的高靈敏度成像。

     配合Ni-E正置顯微鏡

  | 高達420幀/秒成像速率的共振掃描鏡     

      尼康所*的共振掃描技術，較之于非共振的普通掃描器，大幅提高了寬視場掃描速率，達到了點掃描成像的世界zui快速率420幀/秒（512X32）。同時在512X512分辨率下亦可以實現30pfs的成像速度（FOV:18mm）。利用多光子顯微術的NDD探測器，可以對非常厚的標本進行深部快速成像。尼康的光學同步（optical pixel clock）技術充分保證了超高速圖像的均勻性和穩(wěn)定性。 

*1 NDD（Non-Descanned Detector）,與共聚焦技術不同，A1R MP不需要使用小孔濾波（descan）。使得NDD探測器可以安裝在zui靠近物鏡出光口的位置，從而可以接收到更多的被厚標本散射的信號光，大幅提高靈敏度。

 | 高速與高質兼?zhèn)洌?同步光活化         

       A1 MP+型配備檢流計掃描頭（非共振）可實現4096X4096高分辨率與10fps高速率成像（512X512）。

       A1R MP+型配備混合型掃描頭同時整合檢流計掃描鏡與超高速共振掃描裝置。的A1R MP+可實現1300nm紅外脈沖光的使用。

       *的混合型掃描頭可提供雙掃描裝置同步工作，在檢流計掃描裝置進行光活化工作時共振掃描裝置同步進行高速成像。是研究細胞內瞬時的變化的工具。

A1R MP+混合掃描頭 

Resonant scanner：共振掃描振鏡

Galvano scanner：檢流計掃描振鏡

 | 高靈敏度NDD深部成像                              

       尼康新開發(fā)的多光子四通道NDD探測器能夠有效地進行標本深部的顯微成像。較普通探測器而言，NDD的感光元件面積更大，靈敏度更高，并安裝于距離物鏡后出光口（back aperture）zui近的地方. 該配置有效地提高了對散射熒光的探測效率，具有更高的信噪比（S/N），對諸如活體組織等較厚的標本的拍攝，具有比普通共聚焦顯微鏡更為清晰穩(wěn)定的圖像質量。

四通道反射NDD                                        四通道透射NDD

*對于標本深部成像來說，非常重要的一點就是要盡可能多地探測到散射熒光。而實際探測深度主要取決于探測器的靈敏度、受光面積以及安裝位置。

活體小鼠大腦皮層深層成像

        H品系5周齡小鼠使用開顱發(fā)研究大腦皮層。通過表達EYFP可見layer V椎體細胞的完整樹突結構，底層與表層都可見。同時亦可觀察到更深白質區(qū)域的熒光。

左側）三維重構圖像                              右側）Z軸切層圖像

上：layer V表層椎體神經元樹突，距表面25μm。

中：layer V椎體神經元底部樹突，距表面625μm。

底：白質熒光。

激發(fā)波長：950nm

物鏡：CFI75 Apo 25xW MP (NA 1.10 WD 2.0)

Photographed with the cooperation of:
Dr. Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University
Dr. Shigenori Nonaka, National Institute for Basic Biology
Dr. Takeshi Imamura, Graduate School of Medicine, Ehime University

小鼠大腦皮層多色成像

       麻醉YFP-H小鼠使用950nm紅外激發(fā)光同時采集三通道圖像，其中包含SHG（ Second Harmonic Generation）圖像與兩通道熒光圖像。

青：硬腦膜SHG信號         黃：EYFP顯示椎體神經元     紅：SRB標記血管

Photographed with the cooperation of:
Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

 | 超高靈敏度GaAsP NDD探測器  New   

      GaAsP（磷砷化鎵）NDD可具有兩倍于普通NDD的靈敏度，可拍攝*的活體樣品更深層的圖像。其更高的靈敏度可以更為快速的獲取圖像并進行更高質量的Z軸拍攝。高靈敏度也可以更低功率的激光進行熒光成像，依減少對活體樣品的光損傷。

      除了可以使用1080nm激光的類型外，我們還為正置顯微鏡提供兼容1300nm的類型。這一新型NDD配合新研制的掃描頭利用1300nm激光可以開到深達1.4mm的深層圖像。

活體小鼠深層大腦成像（1300nm GaAsP NDD）

      活體麻醉YFP-H小鼠（4周齡）開顱?？梢娡暾鹟ayer V的椎體神經元及更深層海馬神經元。大腦深層海馬樹突的三維深層成像。

      使用反射1300nm型GaAsP NDD探測器，CFI Apochromat 25xW MP1300物鏡（NA 1.10, WD 2.0 mm）。 激發(fā)波長：1040nm

Photographed with the cooperation of: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

 活體小鼠大腦GaAsP NDD雙色成像

      活體麻醉YFP-H小鼠（4周齡）開顱觀察大腦皮層，Alexa594尾靜脈注射法顯示血流。

Photographed with the cooperation of: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi and Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

  | 新款高NA物鏡成像更清晰，更明亮        

      新款水浸物鏡在較寬的波長范圍內做了色差校正，并利用尼康——納米水晶鍍膜*技術——保證了在近紫外到近紅外波段內都有很高的透過率。

      如CFI75 Apochromat 25xW MP/MP1300物鏡提供業(yè)內的1.10數值孔徑同時保持2mm的工作距離，它還具有校正環(huán)校正樣品深度同時提供33度*家教可用于電生理實驗。此物鏡是深層多光子成像與生理學研究應用的理想選擇。

*一種原來為尼康半導體光刻機開發(fā)的超低折射率薄膜。由納米顆粒組成海綿狀“粗糙”結構，從而在很寬的光譜區(qū)間上大幅提升了光線透過率，獲得更高信噪比的圖像。

CFI75 Apochromat 25xW MP       CFI Apochromat 40xWI λSCFI Apochromat LWD 40xWI λS  CFI Plan Apochromat IR 60xWI

雙光子物鏡：

 | 快速精準的光譜拆分                                  

      A1R MP不僅可以通過光譜探測器進行32通道的光譜拆分，而且實現了利用四通道NDD探測器的光譜拆分功能。此功能同樣適用于高速共振掃描器。因此，A1R MP可以實現厚標本的深部高速高對比度成像。

 拆分前                                                      拆分后

（85nm紅外激發(fā)三色同時成像） 

 | 多光子激光光束的一鍵準直                      

      當多光子激光的波長或群速色散（GVD）預補償發(fā)生改變時，激光的位置會發(fā)生偏移，導致熒光圖像亮度不均勻，以及單光子圖像與雙光子圖像之間的錯位。
由于人眼無法看見多光子激光，特別是800 nm以上波長。因此多光子激光束的準直工作對普通用戶來說是十分困難也是十分危險的。尼康的A1R MP新開發(fā)的自動光束準直功能可以讓用戶輕點鼠標，NIS-Element C軟件瞬間完成多光子激光的光束準直。