探秘細(xì)胞凋亡

--細(xì)胞凋亡檢測工具大盤點(diǎn)

細(xì)胞凋亡是一個(gè)神秘的過程，在機(jī)體內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著……

何為細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡過程。 細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，zui終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

圖1：細(xì)胞凋亡過程

細(xì)胞凋亡的三個(gè)典型特征：

細(xì)胞處于不同的凋亡階段具有不同的生物學(xué)特征，典型的特征包括：1）細(xì)胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻；2）線粒體膜電位喪失；3）細(xì)胞核濃縮和斷裂

想要探秘凋亡處于哪個(gè)階段，小編為您支三招。

工具1 ——凋亡早期檢測

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS由細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

工具2——凋亡中期檢測

線粒體膜電位（△Ψm ）的丟失導(dǎo)致線粒體膜中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，細(xì)胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細(xì)胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

工具3——凋亡晚期檢測

細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3’--OH末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）

細(xì)胞凋亡檢測三把斧，您get到了嗎？

附上小編一些檢測實(shí)驗(yàn)TIPS

AnnexinV/PI檢測

Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動(dòng)物細(xì)胞凋亡情況？

A：可以。因?yàn)?/span>Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結(jié)合，而PS不存在種屬間差異。

Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進(jìn)行凋亡檢測，用含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞對結(jié)果有影響嗎？

A：會(huì)。因?yàn)?/span>Annexin V 是Ca²⁺ 依賴的蛋白，EDTA會(huì) 螯合Ca²⁺從而影響Annexin V與PS 的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：如果細(xì)胞自帶GFP蛋白，請問哪種凋亡檢測試劑盒適用該細(xì)胞的凋亡檢測？

A：選用PE標(biāo)記或者APC標(biāo)記的Annexin V凋亡檢測試劑。

Q：對于來自血液的細(xì)胞樣品，為什么去除血液中的血小板？

A：因?yàn)檠“逯泻?/span>PS，其能與Annexin V結(jié)合進(jìn)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：Annexin -V 在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？

A：由于Annexin -V染料上帶有熒光基團(tuán)，在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育；為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性應(yīng)在染色后1h內(nèi)上機(jī)檢測。

TUNEL檢測

Q：組織切片厚度多少比較合適？

A：組織切片過厚，會(huì)使得固定效果不理想，控制在10 μm以內(nèi)。

Q：除了多聚甲醛固定，可不可以使用甲醇固定？

A：使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。酸性固定液，也容易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。建議采用新鮮配置的4%中性多聚甲醛固定液。

Q：如何避免出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記？

A：（1）對于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細(xì)胞，例如平滑肌細(xì)胞，建議取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。

（2）在進(jìn)行末端標(biāo)記的時(shí)候，保證細(xì)胞或組織表面保持濕潤，檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。

Q：Tunel檢測在實(shí)驗(yàn)操作上有哪些注意事項(xiàng)？

A：熒光基團(tuán)長期暴露在普通光照下，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重淬滅，因此在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育。

熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)：

Q：光補(bǔ)償調(diào)節(jié)的原則？

A: 1）用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臉颖颈仨殕稳尽?/span>

2）用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒晒馑乇仨毰c實(shí)驗(yàn)用的熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)EGFP的補(bǔ)償）。

2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如圖所示），但在實(shí)際操作中，只需要保證單染的細(xì)胞不跨區(qū)存在。

Q：如何進(jìn)行光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)？

A：進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，需要設(shè)置幾組對照實(shí)驗(yàn)。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例；

1）空白對照組：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，用于電壓的調(diào)節(jié)，調(diào)整前向散射和側(cè)向散射，得到清晰劃分的細(xì)胞群體。

2）凋亡誘導(dǎo)的單染組：陽性對照的細(xì)胞群體需要超過分析的細(xì)胞群體的10%，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

3）雙染實(shí)驗(yàn)組：利用空白對照組和單染組調(diào)節(jié)好的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得。