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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動物的IgG。然而兩者結(jié)合特異性上有所不同（詳細見附錄1，蛋白A，G對不同物種Ig的結(jié)合能力總表），如蛋白G對人IgG3，大鼠IgG2a，綿羊IgG1具有很高的親和力，但蛋白A對這些Ig結(jié)合力很弱。蛋白A，蛋白G常共價偶聯(lián)在固體載體如瓊脂糖珠或丙烯酸樹脂小珠上，直接用以做免疫沉淀（IP）或者免疫共沉淀（Co-IP）來進行蛋白功能相關(guān)研究，或者直接裝在層析柱上來純化單克隆或者多克隆抗體。

本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。本品同時將蛋白A和蛋白G共價偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面，比單獨的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結(jié)合范圍，適合于所有蛋白A瓊脂糖珠和蛋白G瓊脂糖珠單獨可以結(jié)合的Ig，實用性更高。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸與保存方法

冰袋運輸。4℃保存，2年有效。

需準備試劑

【注】：建議以下緩沖液在使用前用0.22μm或0.45μm濾膜過濾。

結(jié)合/洗雜緩沖液：0.15M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脫緩沖液：0.1M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5

交聯(lián)緩沖液：0.2M 三乙醇胺，pH8.2

終止液：50mM Tris-HCl，pH 7.5

使用方法

一、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）:

1蛋白樣品的準備：

① 貼壁細胞：取10 cm細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，然后加入500 µl至2 ml細胞裂解液裂解細胞（如RIPA裂解液）；

② 懸浮細胞：離心收集細胞后，PBS洗滌1次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解；

③ 動植物組織樣本：參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解；

【注意】：a）具體的裂解方法，應(yīng)參考不同裂解液的詳細使用方法；b）不同量的細胞，應(yīng)選用適當裂解液的用量進行裂解（如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量），通常裂解液zui終總蛋白濃度選擇在0.5-1ug/ul范圍內(nèi)較合適；c）可選：細胞或組織處理時加入廣譜核酸酶Benzonase（Yeasen Cat#20125），能夠降解所有形式的DNA和RNA(單鏈、雙鏈、線形和環(huán)狀)，而無蛋白水解活性。此步操作可以降低背景，保障實驗的可重復(fù)性。

2 去除非特應(yīng)性結(jié)合（可選）：

① 取0.2-1 ml 細胞或組織裂解液，蛋白量約為0.2-1 mg，加入約1 µg和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 µl充分重懸的Protein A/G Agarose Resin，4℃緩慢搖動30 min~2 h。

② 2500 rpm（約1000g）離心5min，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。

【注】：所謂種屬相同的IgG是指與后續(xù)免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步驟可以預(yù)先去除樣本與Protein A/G Agarose Resin的非特異性結(jié)合，降低背景。

3 免疫沉淀：

1）抗體吸附

① 取適量Protein A/G Agarose Resin加入到2ml離心管中，500rpm離心1min，吸棄上清。

② 加入0.5ml結(jié)合緩沖液重懸樹脂，500rpm離心1min，吸棄上清。繼續(xù)重復(fù)2次此操作。

③ 向上述已平衡樹脂中加入抗體溶液，重懸樹脂，室溫下輕輕翻轉(zhuǎn)離心管或置于翻轉(zhuǎn)混合儀混勻30min后，500rpm離心1min，收集上清液，備用，待檢測。

④ 向上述樹脂中加入0.5ml的洗雜緩沖液，重懸樹脂對其進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，500rpm離心1min，吸棄上清。再重復(fù)2次。

2）抗體交聯(lián)（可選）

【注】：如需將抗體和目標抗原復(fù)合物共同洗脫，請忽略此步驟。

① 向清洗過的樹脂中加入1ml交聯(lián)Buffer，500rpm離心1min，吸棄上清。

② 再向其中加入1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交聯(lián)Buffer，該試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，重懸樹脂，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)，促使Buffer 和樹脂充分接觸，30min后，500rpm離心1min，吸棄上清。

③ 再向其中加入1ml終止液，重懸樹脂，終止交聯(lián)反應(yīng)，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)15min，500rpm離心1min，吸棄上清。

④ 加入0.5ml洗雜緩沖液，重懸樹脂，進行清洗，500rpm離心1min，吸棄上清。再重復(fù)2次。

3）沉淀反應(yīng)

① 抗原吸附：向上述樹脂-抗體溶液中加入含抗原的樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與樹脂-抗體復(fù)合物分散均勻，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)10min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h或者在4℃下反應(yīng)過夜。

② 洗雜：將上述完成抗原吸附的產(chǎn)物500rpm 離心1min，收集上清液置于冰上待檢測。向離心管中加入1ml洗雜緩沖液，用移液器輕輕吹打使樹脂-抗體-抗原復(fù)合物分散均勻，500rpm離心 1min，棄上清。重復(fù)2次，zui后加入1ml洗雜液，將樹脂-抗體-抗原復(fù)合物轉(zhuǎn)移至新的離心管中，500rpm離心1min，吸棄上清。

4 樣品洗脫

【注】：根據(jù)后續(xù)檢測的不同提供兩種洗脫方法。

1） 變性洗脫：該方法適于SDS-PAGE檢測。向上述離心管中加入25µl 1×SDS-PAGE loading buffer 混勻，95℃加熱5min。500rpm 離心1min，收集上清進行后續(xù)WB分析。

2）非變性洗脫：該法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后續(xù)功能分析。具體做法：向上述沉淀反應(yīng)得到的樹脂-抗體-抗原復(fù)合物中加入5倍體積的洗脫Buffer，用移液器輕輕吹打數(shù)次，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)10min，500rpm離心1min，吸取上清，收集洗脫組分，即為目標抗原，將其收集至新的離心管中，立即加入1/10體積的中和液，將洗脫組分PH調(diào)至7.0-8.0，備用。

二、免疫共沉淀 （Co-IP）

1 抗原抗體的結(jié)合：將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合，室溫孵育30-60min，或者4℃孵育過夜。

【注】：① 該步驟孵育時間取決于抗原與抗體的結(jié)合效率以及抗原的穩(wěn)定性，需根據(jù)具體情況進行優(yōu)化；② 抗體的加入量需參考后續(xù)加入樹脂的量，抗體加入量過多會導(dǎo)致抗原-抗體混合物與樹脂的結(jié)合。推薦抗體加入量為樹脂80%的zui大載量。

2 樹脂準備：

1）取適量Protein A/G Agarose Resin加入到2ml離心管中，500rpm離心1min，吸棄上清。

2）加入0.5ml結(jié)合Buffer 重懸樹脂，500rpm離心1min，吸棄上清。繼續(xù)重復(fù)2次此操作。

3 抗原-抗體混合物的吸附：將步驟1中抗原-抗體混合物加入到已處理的樹脂中，混勻，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)30min，使其充分接觸并吸附，500rpm離心1min，收集上清留待檢測。

4 洗雜：向上述離心管中加入0.5ml洗雜緩沖液，重懸樹脂，去除非特異性結(jié)合，500rpm離心1min，吸棄上清。再重復(fù)2次此操作。

5 抗原洗脫（根據(jù)后續(xù)檢測的目的提供兩種抗原洗脫方法，同免疫沉淀法洗脫）

注意事項

1）請勿冷凍保存本產(chǎn)品。

2）Protein A/G瓊脂糖珠使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

3）所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

附錄  蛋白A，G對不同物種Ig的結(jié)合能力總表（見下）

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