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Total Superoxide Dismutase Activity Colorimetric Assay Kit II

總SOD活力檢測試劑盒II（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(H₂O₂)和氧氣(O₂)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。

目前有多種SOD活性測定方法，其中NBT（氮藍四唑）法和細胞|色素|C法都是常用的檢測方法。但WST-8法更為先進，穩(wěn)定性更好、靈敏度更高。其基本檢測原理是：

黃|嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)催化產(chǎn)生超氧化物陰離子，該超氧化物陰離子可以與WST-8反應產(chǎn)生水溶性的甲臜(formazan)產(chǎn)物，而SOD可以抑制上述反應。通過分析甲臜產(chǎn)物OD值，可計算SOD的酶活力。

檢測原理圖如下：

本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、全血、紅細胞抽提物、血清等多種生物樣品中的SOD活性。按照試劑盒提供使用步驟操作，1個試劑盒可供100次檢測。適合用于高通量篩選研究。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1）WST-8反應產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物；

2）WST-8法可以通過檢測單個時間點的吸光值測定SOD活力；

3）WST-8法測定時///大抑制百分率可以接近100%；

4）不受樣品中過氧化氫的干擾，本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。 -20℃保存，有效期6個月。【注】：WST-8溶液需避光保存。

注意事項

1）待測樣品可-70℃保存一個月，避免反復凍融導致SOD部分失活；

2）細胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，會干擾檢測；

3）抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。如果設置了使用說明中的空白對照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1．樣品的制備

① 細胞樣品

1000-2000g，4℃離心10min收集細胞，預冷PBS或生理鹽水洗滌1-2次。預冷PBS重懸細胞并于冰浴進行勻漿（可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器）。隨后勻漿液1500g，4℃離心5min，取上清待測。

② 組織樣品

動物解剖前用生理鹽水（0.9% NaCl，含有0.16mg/mL肝|素|鈉）灌流*清除紅細胞及血坨，取適量的組織樣品，加入預冷的PBS于冰浴進行勻漿（可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器）。隨后勻漿液1500g，4℃離心5min，取上清待測。

③ 血漿或紅細胞樣品

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃，600 g離心10min，移取上清至新的1mL離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細胞樣品可以參考步驟① 細胞樣品的制備方法，或其他不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。

【注】：a. 上述樣品準備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Yeasen 20201）測定蛋白濃度。通常10-20µg蛋白的細胞        或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作參考)。每種樣品準備20-100µg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。

b. 根據(jù)蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。

c. 準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，于-80℃凍存可保存至少1個月。但建議盡量當天完成測定。注意反復凍融會導致SOD部分失活。

2. 試劑盒的準備工作

① WST-8/酶工作液的配制

按照每個反應160μL的體積配置適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151μL SOD檢測緩沖液、8μL WST-8和1μL酶溶液，即可配置成160μL WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品（包括標準品）的數(shù)量，配置適量的WST-8/酶工作液。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注】：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當混勻后再使用。

② 反應啟動工作液的配制

把試劑盒中的反應啟動液(40×) 融解后混勻，按照每1μL反應啟動液(40×)加入39μL SOD檢測緩沖液的比例進行稀釋，混勻后即為反應啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標準品)的數(shù)量，配置適量的反應啟動工作液。配制好的反應啟動工作液4℃或冰浴保存， 可以在當天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

③ （可選）SOD標準品準備

需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標準品稀釋至以下系列濃度：200U/mL，100U/mL，50U/mL，20U/mL，10U/mL，5U/mL，2U/mL。在隨后的檢測中可以各取20µL，參考樣品進行檢測。

【注】：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標準品需現(xiàn)配現(xiàn)用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標準品，但可以使用SOD標準品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。

3. 樣品測定

① 參考下表使用96孔板設置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應啟動工作液后充分混勻。

【注】：加入反應啟動工作液后反應即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應啟動工作液的時間先后差異而導致的誤差。

【*】：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設置空白對照3。

② 37℃孵育30min。【注】：孵育25-35min檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結果的*性，推薦孵育30min。③ 在450nm測定吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于650nm的波長作為參考波長進行雙波長測定。

4. 樣品中總SOD活力的計算

① 抑制百分率的計算

     參考如下計算公式計算抑制百分率：

     抑制百分率＝[(A_{空白對照1}－A_{空白對照2})－(A_樣品－A_{空白對照3})]/(A_{空白對照1}－A_{空白對照2})×100%

     如果沒有設置空白對照3，則可以把計算公式簡化為：

     抑制百分率＝(A_{空白對照1}－A_樣品)/(A_{空白對照1}－A_{空白對照2})×100%

    【注】：盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度較高的待測樣品。

 ② SOD酶活力單位的定義：在上述黃|嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。

【注】：SOD活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進行適當換算。

 ③ SOD酶活力的計算

SOD酶活力的計算公式如下：

待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率) units

例如，當抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。

④ 如果樣品為細胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

其他SOD檢測參考方案

1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標準品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標準品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。

此外，本方案需確保標準品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標準品的保存問題而導致實際酶活力下降。

2：SOD酶活力的動力學檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學方法檢測SOD的酶活力。通常在【步驟3 ① 后可以37℃孵育同時在560nm連續(xù)測定吸光度30min。根據(jù)30min內(nèi)的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(斜率_{空白對照1}－斜率_{空白對照2})－(斜率_樣品－斜率_{空白對照3})]/(斜率_{空白對照1}－斜率_{空白對照2})×100%

其余的計算方法同上述非動力學的計算方法。動力學方法的檢測和計算更加精///確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。

使用本試劑盒通常使用非動力學方法即可。