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Fluo-3, AM, Cell Permeant細(xì)胞膜可滲透鈣離子熒光探針

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Fluo-3, AM是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針。Fluo-3, AM鈣離子探針穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會(huì)隨鈣離子濃度升高而增強(qiáng)。但是，當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，熒光會(huì)增加60至80倍，zui大激發(fā)波長(zhǎng)為 506nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為 526nm。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為 525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

本產(chǎn)品以粉末形式提供，使用時(shí)可用高質(zhì)量無(wú)水DMSO配制成2-5mM的儲(chǔ)存液分裝保存。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

室溫運(yùn)輸。粉末-20℃干燥避光保存，有效期一年。

注意事項(xiàng)

1）熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）乙酰氧基甲基酯（Acetoxymethyl ester，AM）容易吸潮，從冰箱取出后，請(qǐng)確認(rèn)在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑極其微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）*次使用時(shí)，建議母液現(xiàn)配現(xiàn)用。且溶解后的試劑盡可能在短時(shí)間內(nèi)使用，以保證實(shí)驗(yàn)效果。

4）母液遇水極易分解，若單次不能用完，建議分裝保存，例如5μl/管，用封口膜封口，并嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥保存。

5）建議您在正式實(shí)驗(yàn)前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時(shí)間等，找到*實(shí)驗(yàn)條件。

6）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

試劑準(zhǔn)備

1）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks•balanced salt solution（HBSS,不含Ca²⁺, Mg²⁺）（Cat No. 60161ES76）

操作方法

1）Fluo-3,AM儲(chǔ)存液的配制

利用高質(zhì)量無(wú)水DMSO溶解Fluo-3,AM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，該儲(chǔ)存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回溫至室溫。

【注】：① 因?yàn)?/span>Fluo-3,AM在水中的溶解性和穩(wěn)定性較差，不可用水溶性緩沖液配制Fluo-3,AM儲(chǔ)存液。

② 溶解用的DMSO需要保證新鮮無(wú)水，否則將會(huì)導(dǎo)致AM 體水解，使熒光染料無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果。

2）Fluo-3,AM工作液的配制：利用HBSS將Fluo-3,AM稀釋成1-5µM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 µM工作液，用1 mL HBSS溶液稀釋4 µL 1mM母液即可。

【注】：① 推薦該探針加載濃度在4-5µM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用zui低探針濃度。

② Fluo-3,AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）（可選）如果Fluo-3進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，可向 Fluo-3, AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F-127溶液，zui終稀釋至其終濃度為0.02-0.05%，Pluronic F-127 可以防止 Fluo-3, AM 在 HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

【注】：Pluronic F-127可降低Fluo-3,AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議將其加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

4）取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會(huì)分解 AM 基團(tuán)，從而降低 Fluo 3-AM 進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會(huì)使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將Fluo-3, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)15-60min，然后除去Fluo-3, AM工作液。

【注】：① 關(guān)于孵育的時(shí)間，如果*做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

② 降低加載溫度可能會(huì)減少探針AM酯運(yùn)載技術(shù)造成的探針區(qū)室化。

6）用HBSS溶液洗滌細(xì)胞 3 次，以充分去除殘留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細(xì)胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約20-30min，以確保 AM 基團(tuán)在細(xì)胞內(nèi)的*去酯化作用。

【注】：（可選）對(duì)于含有陰離子通道蛋白的細(xì)胞，5-7步驟中可加入有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑probenecid（1-2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)到細(xì)胞外液以減少指示劑去酯后的滲漏。

8）激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)506nm，發(fā)射波長(zhǎng)526nm。

【注】：標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類(lèi)而異，每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先確定*條件。以上方法僅供參考。