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如何完成western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
閱讀：3521 發(fā)布時(shí)間：2015-11-18
本公司可為您提供專業(yè)的western blot檢測(cè)服務(wù)，歡迎有需要的客戶前來(lái)咨詢。
western blot檢測(cè)服務(wù)（蛋白印跡雜交），又稱免疫印跡(immunoblotting)，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一，主要利用抗原抗體反應(yīng)，目前該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的十分成熟，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都已具備western blot檢測(cè)的能力，但是如果想要得到一份真實(shí)客觀。條理清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就需要我們花很大功夫，下面小編就為大家詳細(xì)介紹一下關(guān)于western blot檢測(cè)服務(wù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的一些操作。
1、蛋白質(zhì)抽提
1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白。
2）實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。
2、蛋白質(zhì)定量：按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。
3、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)：將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個(gè)孔中，電泳分離蛋白。
4、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜
5、膜的封閉和抗體孵育
1）膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。
2）封閉過(guò)的膜加入一級(jí)抗體室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。
3）加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。
6、結(jié)果檢測(cè)：化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7、數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
8、提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。