人偏肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Human Metapneumo Virus(hMPV)

產品及特點

人偏肺病毒(Human Metapneumo Virus,hMPV)是一種RNA病毒，是一種新近發(fā)現(xiàn)的呼吸道致病病毒。感染主要發(fā)生在冬春季，各年齡階段的人群都可受到感染，尤其是兒童、老年人和免疫缺陷患者。世界各國報道其感染率不徑相同，感染癥狀可從輕微的上呼吸道病變到嚴重的細支氣管炎和肺炎，因此人偏肺病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2.根據(jù)人偏肺病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。
4.使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

人偏肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA段作為陽性對照。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣 品做陽性對照，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照 梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

7. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三、設置 RT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

8. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照，6 個用于 RT-PCR 陽性對照。 9. 在標記管中按下表加入各成分： 

9. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性