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          ProAqa抗體親和分析色譜柱及小規(guī)模制備柱

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          • ProAqa抗體親和分析色譜柱及小規(guī)模制備柱
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          更新時(shí)間:2016-09-19 20:12:25瀏覽次數(shù):533

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          ProAqa抗體親和分析色譜柱及小規(guī)模制備柱是設(shè)計(jì)用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。是設(shè)計(jì)用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。

          詳細(xì)介紹

          ProAqa親和色譜柱是設(shè)計(jì)用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。其固定相采用平均粒徑為20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯(PS/DVB)為基質(zhì),表面鍵合一層親水涂層,涂層上以化學(xué)鍵合的方式連接了蛋白質(zhì)A,蛋白質(zhì)A可結(jié)合除IgG3之外的含 Fc片段的免疫球蛋白。該色譜柱可用于抗體和融合蛋白(可特異性結(jié)合重組蛋白A)的定量和小規(guī)模純化。

          Figure 1.抗體樣品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲線(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。流動(dòng)相:磷酸鈉緩沖溶液,0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321;流速:2.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm

              

           

          技術(shù)參數(shù)

          項(xiàng)目

          詳細(xì)信息

          基質(zhì)

          交聯(lián)聚苯乙烯二乙烯基苯

          固定配體

          重組蛋白A

          動(dòng)態(tài)結(jié)合載量

          9.3 mg/ml (DBC曲線見Fig. 1 )

          運(yùn)輸溶液

          0.1 M 磷酸鈉,pH 7,0.02% *

          壓力限

          180 bar

          zui大操作流速

          5000 cm/hour

          pH范圍

          2-10

          離子強(qiáng)度

          0-5 M,所有常見鹽

          緩沖液

          常見緩沖液,包括4 M 尿素,3 M鹽酸胍,乙二醇以及一些變性劑

          溶劑

           

           

          水,0–90%乙醇,乙腈以及一些常見有機(jī)溶劑。

          注: 不可含有可降解和破壞蛋白質(zhì)A的組分。

          操作溫度

          2-40 °C, 不可冷凍

           

          空白運(yùn)行

              必須使用高純度的緩沖鹽,并在使用前過濾(0.22 or 0.45 μm)所有的緩沖溶液。

              上樣前,必須執(zhí)行空白運(yùn)行,并監(jiān)測(cè)本底。為了減小結(jié)合和洗脫緩沖溶液之間變化產(chǎn)生的基線變化,建議使用:    
          (a) 50 mM磷酸鹽 pH 7, 0.15 M NaCl 作為起始/淋洗緩沖溶液,以及
          (b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作為洗脫緩沖液。

              以上是zui有效的淋洗/洗脫系統(tǒng),產(chǎn)生的基線波動(dòng)zui小。如果要求洗脫樣品保留生物活性,不建議使用鹽酸(HCl),因?yàn)辂}酸會(huì)使抗體變性。

           

          樣品的準(zhǔn)備和上樣

              為了確保樣品的有效結(jié)合和避免色譜柱篩板被污染,一般按照以下方式來準(zhǔn)備樣品:
          (a) 將樣品溶解到或溶劑替換為起始/淋洗緩沖液,這對(duì)于大體積樣品尤為重要(超過25%的柱體積)。
          (b) 進(jìn)樣前離心或過濾樣品 (0.22 或0.45 μm)。
          (c) 對(duì)血清樣品進(jìn)行熱處理(置于56 °C 下30分鐘)以去除會(huì)堵塞色譜柱的纖維蛋白原。
          (d) 對(duì)樣品進(jìn)行去脂處理,因?yàn)橹悤?huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不可逆的污染。
          (e) 所有樣品使用前應(yīng)該用0.45 μm或0.2 μm濾膜過濾。

              為了確保樣品的有效結(jié)合和避免填料與色譜柱被污染,需要對(duì)樣品載量進(jìn)行測(cè)定:
          (a) ProAqa 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量見“描述”。
          (b) 其它抗體的結(jié)合載量取決于抗體來源與所屬子類以及所使用的配體。但是一般會(huì)低于“描述”中IgG的載量。
          (c) 當(dāng)作為分析用途時(shí),可通過標(biāo)準(zhǔn)線性曲線測(cè)定zui小和zui大上樣量。

           

          起始/淋洗緩沖液

          (a) 絕大多數(shù)情況下,使用簡(jiǎn)單的緩沖鹽如10 ~ 50 mM 磷酸鹽或Tris。
          (b) 起始/淋洗緩沖液的pH范圍可在6.0到9.0之間,但需注意當(dāng)pHzui高的時(shí)候結(jié)合力zui強(qiáng)。
          (c) 加入一些鹽 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特異性吸附。

           

          洗脫條件

              如果色譜柱作為分析用途,洗脫緩沖液為含25-100 mM 磷酸鹽,pH為 2.0-3.5,含0-150 mM氯化鈉的溶液。其它可能會(huì)用到的洗脫緩沖鹽組分包括鹽酸、甘氨酸、檸檬酸、乙酸或其它可調(diào)低pH的組分。

              如果色譜柱作為制備用途,可采用以下條件。
          (a) 對(duì)于絕大多數(shù)抗體的洗脫,可將pH降至2-3,常用緩沖體系包括磷酸鹽、乙酸鹽、鹽酸和甘氨酸。根據(jù)緩沖體系的不同,緩沖鹽濃度為6-100 mM或2-20% (v/v)。
          (b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl來獲得理想的pH范圍,并將基線波動(dòng)降到zui低程度。
          (c) 由于抗體會(huì)因其種類和所屬子類的不同而表現(xiàn)出不同的結(jié)合/洗脫行為,*的洗脫條件需要通過經(jīng)驗(yàn)性地測(cè)定。

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