D-熒光素鉀鹽基本特性：

1CAS NO：115144-35-9

2化學(xué)名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3分子式：C11H7N2O3S2K

4分子量：318.42 g/mol

5純度：＞99% (HPLC)，分子生物學(xué)級（超純）

6外觀：淺黃色至黃色粉末7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）

使用方法：

A．體外生物發(fā)光檢測

1儲存液制備用蒸餾水溶解D-熒光素鉀鹽，配制成15mg/ml的儲存液（100×），混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。建議使用的工作液濃度為150µg/ml（相當(dāng)于468µM）。

2熒光素酶反應(yīng)緩沖液制備配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來調(diào)整。按照以上配方制備熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）。

3收集細胞裂解上清（熒光素酶表達）根據(jù)需要檢測的細胞類型，選擇合適的裂解液進行細胞裂解，離心收集上清后續(xù)檢測待用。

4螢火蟲熒光信號檢測

【注①】：螢火蟲熒光信號的檢測方法大體上取決于冷光測定儀（luminometer）類型（是手動型熒光計、單管注射型或者酶標(biāo)板讀數(shù)型熒光計）。根據(jù)特定發(fā)光測定儀，來考慮注射用量和程序設(shè)置。

【注②】：需設(shè)置不含熒光素酶的孔（用作陰性對照），以測定背景熒光。

例：注射式冷光測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200µl終體積）。

a吸取100µl熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）到一干凈的冷光測定儀比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b吸取50~98µl裂解上清到皿或孔內(nèi)；

c如果有需要，用水來補足使得總體積到198µl；

d設(shè)置程序注射2µl熒光素儲存液（使工作濃度150µg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測定。

B．活體成像分析

1用無菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光素（鉀鹽）工作液（15mg/ml），0.2µm濾膜過濾除菌。混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2注射量取決于注射方式，具體如下：注射方式劑量靜脈注射（25-27 gauge針頭）    按10µl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液    腹腔注射（25-27 gauge針頭）按10µl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液肌肉注射（27 gauge針頭）50µl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液鼻內(nèi)注射（pipette）50µl，濃度為3mg/ml熒光素工作液。

3注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號達到較好的穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析。注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學(xué)曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。