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        1. 上海仁捷生物科技有限公司

          人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

          時(shí)間:2023/3/29閱讀:1071

          人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

          實(shí)驗(yàn)原理 

          本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 。往預(yù)先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中, 依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體,HRP 酶結(jié)合物,中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,用底物 TMB 顯色,TMB 在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素  (INS) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 (OD ) ,計(jì)算樣品濃度

          操作步驟 

          1.  從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

          2.  加樣:分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100 μ l 每孔加入相應(yīng)孔中,空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時(shí)。  (建議:將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。 減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響,最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔) 。

          3.  加生物素化抗體:取出酶標(biāo)板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL,蓋上  37℃溫育 1 小時(shí)。

          4.  洗板:棄去液體,每孔加入 300 μL 1x 洗滌液,靜置 1 分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板

          3 次 (也可用洗板機(jī)洗板) 。

          5.  加酶結(jié)合物工液:每孔加入酶結(jié)合物工作液 100 μL,蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

          6.  洗板:棄去液體按步驟 4 洗滌方法,洗板 5 次。

          7.  加底物:每加入底物(TMB)90 μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育 15 分鐘。

          8.  加終止液:取出酶標(biāo)板,每孔直接加入終止液 50 μL,立即在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 



          結(jié)果判斷:

          1.  計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo), 雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。

          2.  若樣品OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

          型數(shù)據(jù)和參考曲線:

          以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

          image.png

           

           

           (ng/mL)

          10

          5

          2.5

          1.25

          0.625

          0.312

          0. 156

          0

          OD 

          2.22

          1.56

          0.92

          0.63

          0.42

          0.25

          0. 18

          0.08

          OD 

          2. 14

          1.48

          0.94

          0.55

          0.34

          0. 17

          0.1

           

          -





          盒性能 

          1.  重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于 10%,板間變異系數(shù)小于 10%

          2.  回收率:在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 INS,計(jì)算回收率

           

          本類型

          均回收率

           (n=8)

          84- 101

          96

          漿(n=8)

          92- 105

          102

          細(xì)胞培養(yǎng)上清(n=8)

          96- 108

          105

           

           

          3.  線性稀釋:分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍

          內(nèi)進(jìn)行稀釋,評(píng)估線性。評(píng)估線性。

          本試劑只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷          6


           

           

          稀釋比

          收率  (%)

          漿

          細(xì)  培養(yǎng)

          1 2

           (%)

          84-95

          88-96

          90- 110

          均回收率  (%)

          91

          93

          96

          1 4

           (%)

          89- 103

          87- 108

          105- 115

          均回收率  (%)

          94

          98

          108

          注意事項(xiàng)

          1.  嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃ 。使用

          后立即冷藏保存試劑。

          2.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。

          3.  消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD 值。

          4.  底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

          5.  避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

          6.  在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

          7.  平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

          8.  任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑

          的生物活性。

          9.  不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

          10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。


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