概述
免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程:樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備(一)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選(二)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定(三)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之擴(kuò)增&培養(yǎng)(四)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之質(zhì)量優(yōu)化(五)》今天我們繼續(xù)來了解一下后續(xù)研究。
后續(xù)研究(Follow-Up Study):運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究免疫細(xì)胞的功能(殺傷能力、分泌細(xì)胞因子、吞噬功能、增殖能力等)。免疫細(xì)胞可以做的后續(xù)研究實(shí)在是太多了,比如:CAR-T/NK/M,腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)、類器官免疫共培養(yǎng),細(xì)胞因子風(fēng)暴等等,小愛在這里拋磚引玉,給大家介紹3個(gè)免疫細(xì)胞研究的熱門思路:NK細(xì)胞殺傷能力鑒定、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、Treg體外抑制實(shí)驗(yàn)。
NK細(xì)胞殺傷能力鑒定
NK作為自帶免疫記憶的自然殺傷細(xì)胞,對其殺傷功能的研究也是十分火熱。
NK細(xì)胞主要通過以下四個(gè)途徑殺傷靶細(xì)胞:
①NK細(xì)胞脫顆粒,釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞;
②活化的NK細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子來殺傷靶細(xì)胞;
③通過死亡受體如Fas/FasL和TNF-α/TNFR-1途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡;
④介導(dǎo)ADCC作用殺傷靶細(xì)胞[1]。
圖1 NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的四種途徑
體外研究NK細(xì)胞殺傷功能主要是將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞(通常是K562細(xì)胞)共培養(yǎng),然后通過檢測靶細(xì)胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞,通過檢測熒光,也可以通過MTT/CCK8檢測細(xì)胞數(shù)量,從而得出NK細(xì)胞的殺傷活性,也可以檢測NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或者脫顆粒指標(biāo)CD107a。當(dāng)然我們可以換成其他的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。
小愛也給大家整理了步驟可以參考:
1、將用熒光染料GFP,CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞(一般為腫瘤細(xì)胞)接種到96孔板中,不同腫瘤細(xì)胞的接種密度可以參考圖2;
圖2 用于NK和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中不同腫瘤細(xì)胞的接種密度
2、第二天,將培養(yǎng)基更換成NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系,并按照靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(NK)1:3的比例加入NK細(xì)胞,0-12h分別進(jìn)行熒光顯微鏡拍照;
注意:靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)比例以及時(shí)間均需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。
圖3 不同上皮細(xì)胞系在與NK共培養(yǎng)中的累積存活曲線
表1 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格
名稱 | 貨號 | 應(yīng)用 |
人自然殺傷細(xì)胞(NK)擴(kuò)增試劑盒 | abs9824 | NK細(xì)胞培養(yǎng) |
Recombinant Human IL-15 Protein | abs00818 | 細(xì)胞因子(國產(chǎn)高性價(jià)比) |
Recombinant Human IL-2 Protein | abs00804 |
混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)
混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)也稱作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),是指在抗原提呈細(xì)胞刺激下,T細(xì)胞發(fā)生增殖和活化,根據(jù)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度來評價(jià)組織相容性抗原差異和對異體細(xì)胞的反應(yīng)能力??梢苑譃?strong>雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。體外研究中,通常也會檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、T細(xì)胞增殖抗原CD107a。
雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將來自兩個(gè)不同供體的 PBMC 共培養(yǎng),使來自兩個(gè)供體的T細(xì)胞發(fā)生雙向活化。
單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將從一個(gè)供體分離的 CD4+T細(xì)胞與從另一個(gè)供體分離的DC相結(jié)合,從而使 T 細(xì)胞發(fā)生單向活化。
圖4 單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體外研究示意圖
小愛以單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為例給大家介紹實(shí)驗(yàn)步驟:
1、用50μg/mL的絲lie霉素37℃處理來自供體B的PBMCs 30min,這些細(xì)胞作為刺激細(xì)胞;
2、300×g離心5min,去除絲lie霉素,按照2x106個(gè)PBMCs/mL(或者磁珠分選出DC細(xì)胞)接種到24孔板(250uL)中;
3、再加入250uL來自供A的個(gè)PBMCs(2x106cells/mL)(或者磁珠分選出T細(xì)胞),作為應(yīng)答細(xì)胞;
4、將刺激細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞構(gòu)成的MLR置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)七天;
5、7天后可以檢測應(yīng)答細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌情況。
表2 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格
名稱 | 貨號 | 應(yīng)用 |
人淋巴細(xì)胞分離液 | abs930 | 獲得PBMCs |
CD3/CD28磁珠 | abs160019 | 分選T細(xì)胞 |
CD4+CD25+Treg和CD8+T體外抑制實(shí)驗(yàn)
體外抑制實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢在于,因?yàn)橹挥蠺resp細(xì)胞(CD4+CD25-)或Treg細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng),所以可以直接評估Treg細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。除CD8+T細(xì)胞外,也可以通過改變實(shí)驗(yàn)條件來評估Treg細(xì)胞對其它免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的影響。
小愛也給大家整理了文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)步驟,可以作為參考:
1、CD3/CD28磁珠的清洗:
1)在離心管里重懸磁珠(渦旋超過30s,或者顛倒混勻5min);
2)將確定體積的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中;
3)加入等體積的PBS緩沖液含1%的HSA,或者至少1ml的體積,進(jìn)行重懸;
4)把離心管放在磁力架(磁珠專用)上1min,隨后棄去上清;
5)將離心管從磁力架(磁珠專用)上轉(zhuǎn)移下來,用相同體積的PBS緩沖液含1%的HSA重懸磁珠(第二步最初體積的磁珠)。
2、取50μL CD4+CD25+Treg細(xì)胞(1×105cells/孔)。每孔加50μL CD8+T細(xì)胞作為應(yīng)答T (Tresp)細(xì)胞(1×105cells/孔)。每孔加入已經(jīng)洗過的CD3/CD28磁珠,磁珠和細(xì)胞的比例調(diào)整為1:1 。
注意:在此步驟中,標(biāo)記和建立對照孔如下:未刺激CD8+T(不含anti-CD3/CD28);刺激的CD8+T細(xì)胞(含anti-CD3/CD28);刺激的Treg細(xì)胞(含anti-CD3/CD28)。Treg細(xì)胞可以用wan全培養(yǎng)基稀釋,以不同比例的Tresp細(xì)胞與Treg細(xì)胞(1:0.25-1:1)共培養(yǎng);
3、各孔加50μL或適當(dāng)體積的培養(yǎng)基,總體積為200μL。用鋁箔蓋住板子,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h;
4、培養(yǎng)72h后進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生分析,將每孔上清液分離到另一個(gè)板上,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),檢測IFN-γ水平;
5、將每孔上清液分離后,用FACS緩沖液清洗含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿,4°C,300g離心2min,洗3次;
6、洗滌后,棄去上清。用50μL的抗體緩沖液(anti-CD4、anti-CD8和細(xì)胞活力檢測試劑)重懸細(xì)胞,對增殖的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行染色(在獲得CD8+T細(xì)胞時(shí),可使用追蹤細(xì)胞增殖的染料進(jìn)行標(biāo)記)。4°C避光孵育20min;
7、4°C,300g離心2min,洗兩次。洗滌后,棄上清,用100μL固定緩沖液4℃避光固定20min;
8、4°C,300g離心2min,洗兩次。200μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)記CD8+T細(xì)胞增殖情況。
圖6 活化的Treg細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及分泌IFN-γ
名稱 | 貨號 | 應(yīng)用 |
人T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基 | abs9823 | Human T細(xì)胞活化擴(kuò)增試劑盒(微米級磁珠) |
今天講解就到這了,大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題,歡迎一起交流哦!
本期小愛推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
abs9824 | 人自然殺傷細(xì)胞(NK)擴(kuò)增試劑盒 | 1kit |
abs00818 | Recombinant Human IL-15 Protein | 10ug/50ug/100ug/500ug |
abs00804 | Recombinant Human IL-2 Protein | 10ug/500ug |
abs930 | 人淋巴細(xì)胞分離液 | 200mL/200mL×10 |
abs160019 | CD3/CD28磁珠 | 1mL |
abs9823 | 人T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基 | 1kit |
Absin產(chǎn)品線:
爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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