定量分析是在定性分析的基礎(chǔ)上,需要純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。液相色譜的定量是相對(duì)的定量方法,即:由已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品推算出被測(cè)樣品的量。
液相色譜法定量的依據(jù)被測(cè)組分的量(W)與響應(yīng)值(A)(峰高或峰面積)成正比,W=f×A。定量校正因子(f):是定量計(jì)算公式的比例常數(shù),其物理意義時(shí)單位響應(yīng)值(峰面積)所代表的被測(cè)組分的量。由已知標(biāo)準(zhǔn)樣品的量和其響應(yīng)值可以求得定量校正因子。測(cè)定未知組分的響應(yīng)值,通過定量校正因子即可求得該組分的量。定量分析常用術(shù)語:樣品(sample):含有帶測(cè)物,供色譜分析的溶液。分為標(biāo)樣和未知樣。標(biāo)樣(standard):濃度已知的純品。未知樣(unknow):濃度待測(cè)的混合物。樣品量(sample weight):待測(cè)樣品的原始稱樣量。稀釋度(dilution):未知樣的稀釋倍數(shù)。組分(componance):欲做定量分析的色譜峰,即含量未知的被測(cè)物。組分的量(amount):被測(cè)物質(zhì)的含量(或濃度)。積分(integerity):由計(jì)算機(jī)對(duì)色譜峰進(jìn)行的峰面積測(cè)量的計(jì)算過程。校正曲線(calibration curve):組分含量對(duì)響應(yīng)值的線性曲線,由已知量的標(biāo)準(zhǔn)物建立,用于測(cè)定待測(cè)物的未知含量。常用的定量方法1外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法,分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法在液相色譜中用的zui多。內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確但是麻煩,在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的zui多。用被測(cè)化合物的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品,配制成一系列的已知濃度的標(biāo)樣。注入色譜柱的到其響應(yīng)值(峰面積)。
在一定范圍內(nèi),標(biāo)樣的濃度與響應(yīng)值之間存在較好的線性關(guān)系,即W=f×A,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在*相同的實(shí)驗(yàn)條件下,注入未知樣品,得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。根據(jù)已知的系數(shù)f,即可求出欲測(cè)組分的濃度。
外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn):操作、計(jì)算簡(jiǎn)單,是一種常用的定量方法; 無需各組分都被檢出、洗脫;需要標(biāo)樣;標(biāo)樣及未知樣品的測(cè)定條件要一致;進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確。
外標(biāo)法缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)條件要求高,如檢測(cè)器的靈敏度,流速、流動(dòng)相組成的不能發(fā)生變化;每次進(jìn)樣體積要有好的重復(fù)性。2內(nèi)標(biāo)法
操作:
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入標(biāo)準(zhǔn)樣品,制成混合標(biāo)樣,并配制一系列的已知濃度的工作標(biāo)樣?;旌蠘?biāo)樣中標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)樣的摩爾比不變。注入色譜柱,以(標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)樣峰面積)為響應(yīng)值。根據(jù)響應(yīng)值與工作標(biāo)樣濃度之間存在的線性關(guān)系,即W=f×A,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入未知樣品,注入色譜柱,得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。根據(jù)已知的系數(shù)f,即可求出欲測(cè)組分的濃度。
內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn):操作過程中樣品和內(nèi)標(biāo)是混合在一起注入色譜柱的,因此只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)的量的比值恒定,上樣體積的變化不會(huì)影響影響定量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)法抵消了上樣體積,乃至流動(dòng)相、檢測(cè)器的影響,因此比外標(biāo)法。案例分析案例分析一我做的是苯酚羥基化反應(yīng),產(chǎn)物中有苯酚,苯二酚(鄰,對(duì)),苯醌,焦油,用安捷倫1100液相色譜分析,外標(biāo)法計(jì)算選擇性和轉(zhuǎn)化率。但一直以來,計(jì)算出的結(jié)果老是差強(qiáng)人意。偶爾算出一個(gè)好的結(jié)果,但是一重復(fù)又不行了,有時(shí)候重復(fù)做幾次都不一樣,很是郁悶。zui近又老算出來選擇性超過100%。開始懷疑稀釋誤差的問題(樣品是稀釋以后去測(cè)的),但現(xiàn)在操作的時(shí)候非常小心了,懷疑標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題,但是重新做了好幾條了。結(jié)果就是很奇怪,自己想了想:1.因?yàn)橐合嗌V儀是公用的,所以特意買了的色譜柱。但經(jīng)常測(cè)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)柱壓不一樣,是不是因?yàn)檫@個(gè)影響了峰面積,進(jìn)而影響了結(jié)果?柱壓的影響這么大么?2.是不是外標(biāo)法就不準(zhǔn)確?該用單點(diǎn)校正法?之前覺得每次測(cè)樣前都配一個(gè)標(biāo)樣有點(diǎn)麻煩,所以沒用。3.還是別的什么原因?補(bǔ)充:用的柱子是ZORBAX SB-C18, 用的甲醇:水=3:7,每個(gè)峰都分的很開。取樣后離心去掉催化劑,再定量稀釋然后去測(cè)的。
網(wǎng)友七嘴八舌:
- 有時(shí)候確實(shí)柱壓不同會(huì)對(duì)結(jié)果有影響,但這是柱壓差別很大的情況才會(huì)發(fā)生。是不是柱子沒沖洗好,或者需要看是否進(jìn)氣泡了,因?yàn)檫@都可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)。
- 如果柱壓的差別很大的話,比如30bar已經(jīng)很大了,平時(shí)用的時(shí)候,有柱溫箱,一般都控制溫度恒定的,基本同意條件不會(huì)有這么大的變化,zui多10bar上下浮動(dòng),通常小于5bar。
- 是不是走過緩沖鹽的流動(dòng)相?用水低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗,再換乙腈沖洗試試看。是不是有些不物殘留在柱子中沒有及時(shí)沖洗導(dǎo)致柱壓偏高,可以嘗試用異丙醇試試。
- 柱壓變化主要會(huì)影響保留時(shí)間,對(duì)峰面積影響不大。你所說的重復(fù)性不好,是液相進(jìn)同一個(gè)樣品重復(fù)不好還是不同的樣品。如果不同的樣品那是你反應(yīng)的問題。至于選擇性超過100%?是否是計(jì)算方法錯(cuò)誤?
- 簡(jiǎn)單來說,計(jì)算苯二酚的選擇性:
假設(shè)對(duì)苯峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得濃度C1(g/ml);鄰苯峰面積對(duì)應(yīng)濃度C2,苯酚峰面積對(duì)應(yīng)濃度C,溶液總體積V,稀釋倍數(shù)20,初始苯酚加入量m(g),如下
- 計(jì)算公式如果沒錯(cuò),可以看看是否自己沒有做過空白以及反應(yīng)投料時(shí)的組分測(cè)試。
- 至于單點(diǎn)還是外標(biāo)法?
單點(diǎn)校正比較簡(jiǎn)單,如果要求不是很嚴(yán)格的話,單點(diǎn)校正可以滿足要求。單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)濃度如果在被測(cè)樣品濃度附近,結(jié)果比外標(biāo)法更準(zhǔn)確。做考核樣時(shí),我們一般先用外標(biāo)法定出大致濃度范圍,再以單點(diǎn)法定量。
單點(diǎn)一般適用于線性曲線截距在100%濃度點(diǎn)2%以下的。高于20%不能采用單點(diǎn)校正和外標(biāo)。外標(biāo)法對(duì)照和拱式樣品濃度應(yīng)一致,校正曲線線性符合即可。
案例分析二我想用液相色譜進(jìn)行定量分析,使用外標(biāo)法。問題是:標(biāo)準(zhǔn)曲線是不是每次測(cè)定樣品時(shí)都要做一次?我有200個(gè)樣品,但不是一次能做好,每次我可以測(cè)20個(gè)樣品。難道我每次測(cè)定前都要先做一下標(biāo)準(zhǔn)曲線?我是同一臺(tái)儀器,同一條件。網(wǎng)友七嘴八舌:
從嚴(yán)格意義上來講應(yīng)該是每天做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果你做的東西要求不是太嚴(yán)格(不需要報(bào)批),可以考慮隔幾天做一天標(biāo)曲。不可否認(rèn)的是,每天都做標(biāo)準(zhǔn)曲線能減小測(cè)量的數(shù)據(jù)的誤差。
但是如果是藥品檢測(cè),是應(yīng)該每次開機(jī)測(cè)定樣品前做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線或單點(diǎn)校正標(biāo)準(zhǔn)溶液分析,但普通化工分析要求不嚴(yán)就沒有必要每次做曲線,因?yàn)椴町惒淮蟮?。但如果是檢測(cè)單位檢測(cè)樣品,就要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)來執(zhí)行了。說白了其實(shí)是規(guī)范不規(guī)范的問題。
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