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          如何判斷一只色譜柱的“退休”時(shí)間?

          閱讀:3301      發(fā)布時(shí)間:2018-9-21
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          如何判斷一只色譜柱的“退休”時(shí)間?

          色譜工作者常會(huì)碰到這樣的問題,色譜柱的塔板數(shù)能體現(xiàn)色譜柱的狀態(tài)嗎?如何確定一支色譜柱是否應(yīng)該“退休”?新的色譜柱在使用前都要做什么?如何對柱子進(jìn)行清洗?好的色譜柱應(yīng)具備哪些性能?等等一系列問題,都是今天要和您探討的!

          新色譜柱開啟和安裝推薦步驟

           

          1.使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統(tǒng),確保系統(tǒng)干凈,不含任何緩沖鹽和污染物。

          2.取用色譜柱時(shí)避免磕碰掉落。

          3.將色譜柱入口端連接到系統(tǒng)上,柱出口端先不要連接,色譜柱身上有箭頭標(biāo)明正確流向。

          4.在0.1mL/min流速條件下用純乙腈潤洗色譜柱,然后在2分鐘內(nèi)將流速升至0.5mL/min。

          5.當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出,停流速,將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測器上(這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測系統(tǒng),并且可快速達(dá)到基線平衡)。

          6.重啟流速,按照步驟4的方法逐漸提高流速,至常規(guī)分析時(shí)所使用的流速。

          7.參考柱效測試報(bào)告中的方法,使用該流動(dòng)相條件平衡色譜柱,通常需要使用5-10倍柱體積的流動(dòng)相,直至壓力與基線穩(wěn)定。

          8.測試柱效。如果沒有柱效測試報(bào)告中的分析物,請聯(lián)系廠家部門尋求支持,使用合適的濃度與進(jìn)樣量。柱效結(jié)果略低于柱效測試報(bào)告屬正常情況。如結(jié)果明顯偏低、峰形拖尾,提示色譜柱和/或所使用的液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài),需要進(jìn)行故障排查。當(dāng)使用2.1mm內(nèi)徑色譜柱時(shí),建議優(yōu)化系統(tǒng)以減少譜帶展寬,包括:使用檢測器微量流通池,減少進(jìn)樣器loop環(huán)體積,使用較小內(nèi)徑(如0.005''或0.12mm)的系統(tǒng)管路。并確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無死體積。當(dāng)使用小顆粒填料(如2.5μm)短柱進(jìn)行快速分離時(shí),

           

          需要考慮以下因素:

          1.確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無死體積,盡量優(yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬;

          2.提高采樣頻率至10點(diǎn)/秒以上;

          3.較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高,而較小粒徑要達(dá)到色譜效率所需的線速度較高,請根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實(shí)際情況調(diào)節(jié)流速;

          4.可使用較高的柱溫來補(bǔ)償小顆粒造成的壓力升高,例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時(shí),可使用45?C或更高。

           

          使用反相C18色譜柱總結(jié)的一些小經(jīng)驗(yàn)

           

          1、新柱的處理:我們每次新買的柱子雖然是經(jīng)廠家測試過并密封好的,可是有的柱子到達(dá)手中時(shí)已經(jīng)過很長的時(shí)間了,因此,我們每拿到一根新的色譜柱都必須要對柱子進(jìn)行處理。首先,是配制好65%的乙腈/水,再把色譜柱正確的連接在色譜儀上,出口放空(注意:出口端切不可連上檢測器,以免污染了檢測器),以低流速0.1ml/min~0.5ml/min(如果是LC/MC柱子,則應(yīng)以0.3ml/min進(jìn)行)均可,不可以高流速進(jìn)行,等看見柱子出口有液體流出后,過20分鐘后再接上檢測器,以循序漸進(jìn)的方法將流速調(diào)至1.0ml/min(如果是LC/MC柱子則應(yīng)以0.3ml/min進(jìn)行),繼續(xù)沖洗2~8小時(shí)。

           

          2、新柱的使用:首先我們確認(rèn)所分析樣品流動(dòng)相的PH是不是在色譜柱PH的耐受范圍之內(nèi),以免損傷柱子!如果,確認(rèn)在柱子的使用范圍之內(nèi),就用做樣品的流動(dòng)相平衡柱子(如果流動(dòng)相中含用緩沖鹽溶液,在平衡柱子之前務(wù)必要先用5%甲醇或5%乙腈去過渡30分鐘以上。再用帶鹽的流動(dòng)相去平衡色譜柱。)當(dāng)色譜柱平衡了足夠時(shí)間,基線非常平穩(wěn)的時(shí)候,方可進(jìn)樣分析。不管是分析什么樣的產(chǎn)品,由于各種各樣的因素,樣品中總有雜質(zhì)。因此,在色譜柱前端加上保護(hù)柱。以增加色譜柱的使用壽命!

           

          3、色譜柱清洗:①如果樣品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流動(dòng)相,在做完樣品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水沖洗色譜柱40~80分鐘,然后以純甲醇或乙腈沖洗30分鐘,即可保存;②如果樣品分中流動(dòng)相里含用緩沖液或酸或離子對試劑的流動(dòng)相,在做完樣品之后的清洗必須按照如下步驟進(jìn)行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水,以1ml/min,沖洗1.5小時(shí)以上(如果色譜柱更長,則還需要增加適當(dāng)時(shí)間);然后用55%甲醇/~水65%/水沖洗色譜柱30~60分鐘.后用甲醇或乙腈以1ml/min沖洗30分鐘。

           

          4、色譜柱的再生:當(dāng)色譜柱用過很長的時(shí)間之后,就可能發(fā)生柱壓力升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等等情況,這時(shí)我樣就需要對色譜柱進(jìn)行再生,以延長色譜柱的使用壽命。具體方法有如下兩種:①先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水,把色譜柱反向以1ml/min,沖洗60分鐘以上.然后以1ml/min沖洗30分鐘以上;再用65%甲醇/水或者65乙腈/水,以流速1ml/min沖洗60分鐘。后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存即可。

           

          什么時(shí)候該換新柱了?

           

          1.當(dāng)柱子塔板數(shù)降低到新柱子百分之幾時(shí)該換?

          色譜工作者常會(huì)碰到這樣的問題,什么時(shí)候該換色譜柱了?色譜柱的塔板數(shù)能體現(xiàn)色譜柱的狀態(tài)嗎?確定表明一支色譜柱應(yīng)該“退休”的標(biāo)準(zhǔn),從經(jīng)驗(yàn)來看,當(dāng)一支色譜柱的塔板數(shù)降低到新柱子時(shí)的百分之多少時(shí)就可以認(rèn)為該色譜柱不能再使用了呢?將塔板數(shù)作為評價(jià)色譜柱質(zhì)量的指標(biāo)合適嗎?在您的實(shí)驗(yàn)室里是如何判斷一根色譜柱不可以再用了呢?

          塔板數(shù)是一個(gè)粗略的指標(biāo),不能作為評價(jià)色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)。通常使用塔板數(shù)來考察色譜系統(tǒng):將新柱子接到儀器上,根據(jù)色譜柱生產(chǎn)商提供的測試條件測試該色譜柱,你應(yīng)該得到和分析報(bào)告上同樣的結(jié)果。差也應(yīng)該得到比報(bào)告值低10%的塔板數(shù)。如果你所測得的塔板數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于廠家提供的報(bào)告數(shù)據(jù),這就說明你的色譜系統(tǒng)可能存在一些問題。進(jìn)樣器、柱外效應(yīng)、毛細(xì)連接以及檢測器都是容易出現(xiàn)問題的地方。

           

          2.使用壓力、分辨率和峰形的混合指標(biāo)來考察一根色譜柱的狀態(tài)

          相信每個(gè)色譜工作者都會(huì)關(guān)心分辨率,分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度指標(biāo)。 然而,我們需要考慮的另一個(gè)因素是塔板數(shù)對分辨率的影響僅僅是平方根的關(guān)系,這意味著當(dāng)一根色譜柱的塔板數(shù)下降50%,分辨率僅僅下降7%。而當(dāng)一根色譜柱塔板數(shù)下降為新柱子一半的時(shí)候,你肯定看到了其它更加嚴(yán)重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長了。在實(shí)際的工作中,大多數(shù)色譜方法僅僅需要這些塔板數(shù)的一半,這些色譜方法還有優(yōu)化的空間嗎?答案是肯定的??梢?,色譜柱的塔板數(shù)不是分離中重要的參數(shù)。

           

          較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標(biāo)來考察一根色譜柱的狀態(tài)。

          (1).壓力的測量:是容易的,通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求:用新柱子時(shí)柱壓不高于2500psi,在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現(xiàn)代的液相色譜系統(tǒng)都可在更高的壓力下使用,但由于高壓產(chǎn)生的系統(tǒng)損耗和泄漏的問題會(huì)很嚴(yán)重。當(dāng)壓力超過3000psi時(shí),考慮更換進(jìn)樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高,則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經(jīng)被污染,這提示我們該換柱子了。有統(tǒng)計(jì)表明,超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。

           

          (2).分辨率:是我們考察色譜柱的一個(gè)非常重要的指標(biāo),只要兩個(gè)組分可以獲得基線分離,對該分析物的定量就不會(huì)有什么問題。對于對稱的高斯峰來講,1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴(yán)重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價(jià)指標(biāo)的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。

           

          (3)峰形拖尾:另:一個(gè)考察色譜柱質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是峰形拖尾情況,廠家測試報(bào)告的峰形都非常漂亮,但這并不代表該色譜柱分析實(shí)際樣品的情況。實(shí)際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。值得一提的是含有氮原子的化合物,這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結(jié)合非常緊密,隨著色譜柱使用時(shí)間越長,鍵合相流失,拖尾則更加嚴(yán)重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來。基于此,定一個(gè)拖尾因子的上限,如美國藥典規(guī)定拖尾因子不超過1.8。

           

          3.確定色譜柱“拋棄”標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間

          確定色譜柱“拋棄”標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間是當(dāng)我們開發(fā)分析方法或作方法認(rèn)證的時(shí)候。通常,在開發(fā)分析方法的過程中你會(huì)試驗(yàn)幾根色譜柱,分析足夠多的實(shí)際樣品,你知道當(dāng)分離變差的時(shí)候是什么樣的情況。我傾向于在開始時(shí)使用一個(gè)寬的范圍。我們的經(jīng)驗(yàn)是這樣的:你如果在開始時(shí)緊縮系統(tǒng)適用性要求,在方法認(rèn)證后再放寬這個(gè)要求是很困難的。在分析實(shí)際樣品之前進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察,以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標(biāo)準(zhǔn)。

           

          那么,好的色譜柱應(yīng)該具備的性能有哪些?

           


           

          網(wǎng)友經(jīng)驗(yàn)談:新買的C18色譜柱用前該如何處理?

           

          首先用甲醇或乙腈沖洗,大約20倍柱體積,除新柱子中的有機(jī)雜質(zhì)。然后用10%甲醇或乙腈沖洗10倍柱體積(相比較而言,乙腈價(jià)格比甲醇貴,所以一般用甲醇沖洗,大約4小時(shí)就可以了)。進(jìn)行流動(dòng)相過度,然后就可以運(yùn)行你的流動(dòng)相體系了。用完之后,如果流動(dòng)相中有緩沖鹽,要用10%甲醇沖洗20倍柱體積,如果長期不用,保存在出場溶劑中,短期不用,不用處理,密封后柱子就OK了。

          如果馬上就用,(1)使用的流動(dòng)相中有緩沖鹽,需用一定百分比的甲醇(如:10%甲醇)沖洗半小時(shí),進(jìn)行流動(dòng)相過度,然后就可以運(yùn)行你的流動(dòng)相體系了;(2)使用的流動(dòng)相無緩沖鹽,如甲醇-水(1:1),可直接換流動(dòng)相,待基線平穩(wěn)后可直接進(jìn)樣。

           

          網(wǎng)友經(jīng)驗(yàn)談:新柱子要充分平衡

           

          反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈-水中的;由于色譜柱在儲存或運(yùn)輸過程中固定相可能會(huì)干掉,影起鍵合相的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此新柱子要充分平衡。

           

          反相色譜柱的平衡方法:

          1.以乙腈或甲醇(是色譜純的)為流動(dòng)相,流速:0.2mL/min 沖一夜(小流速過夜沖就行)。

          2.流速改為0.8mL/min 沖上30min直到基線水平為止(正常流速?zèng)_)。

          3.使用時(shí)替換成流動(dòng)相沖基線平了就可以用了。

          正相:改用正庚烷或正己烷。(同同反相)以上均為硅膠鍵合相色譜柱!

           

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