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液相色譜分類(lèi)及基礎(chǔ)原理
液相色譜分類(lèi)及基礎(chǔ)原理
液相色譜是一類(lèi)分離與分析，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜發(fā)展的過(guò)程中。為了區(qū)分多種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色經(jīng)典液相色譜的流動(dòng)相是依靠重力緩慢地流過(guò)色譜柱，因此固定相的粒度不可能太?。?00μm～150μm左右）。分離后的樣品是被分級(jí)收集后再進(jìn)行分析的，使得經(jīng)典液相色譜分離效率低、分析速度慢，而且操作也比較復(fù)雜。直到20世紀(jì)60年代。發(fā)展出粒度小于10μm的固定相，并使用了高壓輸液泵和自動(dòng)記錄的檢測(cè)器，克服了經(jīng)典液相色譜的缺點(diǎn)，發(fā)展成液相色譜，也稱(chēng)為高壓液相色譜。
液相色譜按其分離機(jī)理，可分為四種類(lèi)型。
一、吸附色譜法
吸附色譜法的固定相為吸附劑，色譜的分離過(guò)程是在吸附劑表面進(jìn)行的，不進(jìn)入固定相的內(nèi)。與氣相色譜不同，流動(dòng)相（即溶劑）分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用。在吸附劑表面，樣品分子與流動(dòng)相分子進(jìn)行吸附競(jìng)爭(zhēng)，因此流動(dòng)相的選擇對(duì)分離效果有很大的影響，一般可采用梯度淋洗法來(lái)提色譜分離效率。
在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來(lái)分離添加劑，如偶氮染料、抗氧化劑、表面活性劑等，也可用于石油烴類(lèi)的組成分析。
二、分配色譜法
這種色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體，樣品分子在兩個(gè)液相之間很快達(dá)到平衡分配，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，類(lèi)似于萃取過(guò)程。
一般常用的固定液有β,β\'-氧二（ODPN）和角鯊?fù)椋⊿Q）。采用與氣相色譜（GC）同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面，但在使用中固定液易流失。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面，而是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機(jī)基團(tuán)。
例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基（-OH）之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點(diǎn)是不易被流動(dòng)相剝蝕。在分配色譜法中，流動(dòng)相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進(jìn)行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以防兩者之間相溶。通?？煞譃檎喾峙浜头聪喾峙?。
三、離子交換色譜
離子交換色譜通常用離子交換樹(shù)脂作為固定相。一般是樣品離子與固定相離子進(jìn)行可逆交換，由于各組分離子的交換能力不同，從而達(dá)到色譜的分離。
離子交換色譜法是新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn)代分析技術(shù)，已大范圍用于氨基酸、蛋白質(zhì)的分析，也適合于某些無(wú)機(jī)離子（NO3-、SO42-、Cl-等無(wú)機(jī)陰離子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等無(wú)機(jī)陽(yáng)離子）的分離和分析，具有重要的作用。
四、凝膠色譜法
目前，凝膠色譜法既適用于水溶液的體系，又適用于有機(jī)溶劑的體系。當(dāng)所用的洗脫劑為水溶液時(shí)，稱(chēng)為凝膠過(guò)濾色譜，其在生物界的應(yīng)用比較多；采用有機(jī)溶劑為洗脫劑時(shí)，稱(chēng)為凝膠滲透色譜，在高分子領(lǐng)域應(yīng)用較多。
基本原理
使用液相色譜時(shí)，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì)。液相色譜作為一種重要的分析方法，應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高敏度檢測(cè)器和微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。
什么是液相色譜法（HPLC）?
縮寫(xiě) HPLC，引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會(huì)上的文章，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓。早期的泵只能承受500 psi （35bar）。這就被稱(chēng)為高壓液相色譜法（HPLC）七十年代早期取得大進(jìn)步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6000psi（400 bar）的壓力，還能配上改進(jìn)的進(jìn)樣器，檢測(cè)器和色譜柱。高壓液相色譜法確實(shí)開(kāi)始成為二十世紀(jì)七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)（小顆粒，高壓力），字母縮寫(xiě)保持一樣，但全稱(chēng)變?yōu)椋╤igh-performance） 液相色譜（HPLC）。液相色譜（HPLC）是目前分析化學(xué)的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬(wàn)分之一也可。
一個(gè)儲(chǔ)液瓶裝有溶劑（稱(chēng)為流動(dòng)相，因?yàn)槿軇┦橇鲃?dòng)的）。一個(gè)高壓泵（溶劑傳輸系統(tǒng)或稱(chēng)溶劑管理器）用來(lái)產(chǎn)生和計(jì)量流動(dòng)相的流速，一般是毫升/分鐘。一個(gè)進(jìn)樣器（樣品管理器或自動(dòng)進(jìn)樣器）可以將樣品導(dǎo)入（注射）連續(xù)的流動(dòng)相，并由流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱(chēng)為固定相因?yàn)樗恢布鼑?。檢測(cè)器用來(lái)查看化合物流出色譜柱時(shí)被分開(kāi)的譜帶（大多數(shù)化合物沒(méi)有顏色，所以人眼觀察不到）。流動(dòng)相流出檢測(cè)器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當(dāng)流動(dòng)相含有一個(gè)分開(kāi)的化合物譜帶，液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進(jìn)一步分析。這種方法稱(chēng)為制備液相（在液相色譜量級(jí)中討論）。注意高壓管路和附件用來(lái)連接泵、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測(cè)器單元，形成流動(dòng)相、樣品和化合物分離譜帶的通路。
檢測(cè)器連接計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站，液相色譜系統(tǒng)單元先記錄電信號(hào)，再將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為色譜圖，在顯示屏上展現(xiàn)出來(lái)。定性和定量樣品內(nèi)溶物濃度。由于樣品中化合物性質(zhì)差異很大，幾種類(lèi)型的檢測(cè)器被開(kāi)發(fā)出來(lái)。例如，如果一個(gè)化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測(cè)器。如果這個(gè)化合物發(fā)熒光，可使用熒光檢測(cè)器。如果該化合物沒(méi)有上述性質(zhì)之一，可使用的檢測(cè)器，如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）。方式是順序使用多個(gè)檢測(cè)器。例如，紫外和/或蒸發(fā)光檢測(cè)器可和質(zhì)譜儀（MS）聯(lián)用來(lái)分析色譜分離的組分。這樣，從一次進(jìn)樣，可得到分析物的多綜合的信息。將質(zhì)譜與液相色譜系統(tǒng)耦合稱(chēng)之為液質(zhì)聯(lián)用。