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美國Bio-Rad伯樂pcr儀常見問題
一般為48 h以內，有些于當日電泳檢測，大于48 h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有：
①模板核酸的制備；
②引物的質量與特異性；
③酶的質量；
④PCR循環(huán)條件。

尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
1.  模板：
①模板中含有雜蛋白質；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；
⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
2.  酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
3.  引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。
④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

4.  Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

5.  反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul?；?00 ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
 
6.  物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
 
7.  靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
 
假陽性
出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
1.  引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽 性。需重新設計引物。
 
2.  靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：
①操作時應小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。
②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。
③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
 
出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：
①必要時重新設計引 物。
②減低酶量或調換另一來源的酶。
③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。
④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93 ℃變性，65 ℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：
①減少酶量，或調換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。
③適當降低Mg2+濃 度。
④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產物的優(yōu)條件是什么？
插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5 ul 2X連接液, 50 ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10 ul。室溫保溫1小時，或4 ℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4 ℃過夜。
 
PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
 

如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗
（A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
 
（B）轉化完整質粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率。例如，將1 ug/ul質粒1:100稀釋,1 ul用于100 ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000 ul后，用100 ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉化用10 ng DNA，用SOC稀釋到1000 ul后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。

（C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

（D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

（A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4 ℃過夜。

 
（B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
 
（C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

（D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。

（E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞