本文作者利用飛秒脈沖激光法制備了新型的“超亮Ag2S量子點”，實現(xiàn)了超低劑量注射下的動物活體再深層組織內(nèi)的高分辨成像。

量子點作為一種半導體納米粒子，其吸收和發(fā)射光譜隨尺寸變化而變化，因此量子點在照明、顯示器、激光器和生物熒光成像等領(lǐng)域都有著十分重要的作用。硫化銀（Ag2S）作為典型的二元半導體，其帶隙較窄（約1.1ev），在近紅外區(qū)域具有熒光發(fā)射的性質(zhì)，且由于其較低的毒性在近紅外二區(qū)成像方面具有較好的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)方法制備Ag2S量子點的量子產(chǎn)率低于1%，這是由于傳統(tǒng)的Ag2S量子點表面與結(jié)構(gòu)缺陷以及量子點與溶劑相互作用引起的非輻射途徑增加，此外高溫條件是制備傳統(tǒng)Ag2S量子點所必需的，由于Ag離子具有較高的還原勢能，從而不可避免地形成Ag納米粒子，通過等離子體耦合使得Ag2S亮度降低，而較低的亮度會導致成像信噪比低，空間分辨率不高，為了解決這一問題，作者利用飛秒脈沖激光照射傳統(tǒng)方法制備的Ag2S量子點的溶液，在飛秒時間尺度上發(fā)生Ag+與CHCl3溶質(zhì)分子的超快光化學反應(yīng)，產(chǎn)生的AgCl分子附著在Ag2S納米粒子表面形成一層保護殼，減少了量子點的非輻射途徑，使得新制備的Ag2S“超亮點”量子產(chǎn)率相較傳統(tǒng)Ag2S量子點提升了80倍，PEG化后的“超亮點”可以生物安全級別的低激發(fā)功率激發(fā)（10mW/cm-2）和低劑量給藥（＜0.5mg/Kg），從而在深層組織實現(xiàn)高分辨成像。

基于傳統(tǒng)方法合成的Ag2S量子點，經(jīng)過飛秒脈沖激光照射后，會發(fā)生肉眼可見的變化（圖1a），這種變化體現(xiàn)在吸收光譜上是位于400-500nm波段處傳統(tǒng)的Ag2S量子點有一個突出的肩峰（圖1b），此系Ag納米粒的等離子共振吸收，而“超亮點“無此吸收，這是因為經(jīng)過飛秒脈沖激光處理后”超亮點“內(nèi)的Ag納米粒轉(zhuǎn)化為AgCl保護殼。此外，作者還驗證了飛秒脈沖激光的照射時長為50min（圖1d&e），此外熒光壽命隨著照射時間的變化與量子產(chǎn)率的變化趨勢一致（圖1f）。

圖1：a）Ag2S量子點飛秒脈沖激光處理前（左）與處理后（右）的對比圖；b）Ag2S量子點與Ag2S超亮點吸收光譜；c）飛秒脈沖激光（50fs，90min，9W cm-2）處理前（左）和處理后（右）在808nm連續(xù)波激光激發(fā)下的熒光成像對比圖；d）飛秒脈沖激光不同照射時間下，Ag2S 的CHCl3溶液對應(yīng)的NIR-II發(fā)射光譜。插圖顯示了808nm激光照射前后樣品歸一化后的發(fā)射光譜；e）飛秒脈沖激光不同照射時間下的量子產(chǎn)率（QY）的變化曲線；f）飛秒脈沖激光不同照射時間下的熒光壽命曲線。

為了探究此種現(xiàn)象的原因，作者分別研究了各種因素對實驗產(chǎn)生的影響。作者從飛秒激光功率、溶劑、是否含Ag納米粒以及不同脈沖時間等因素探討了可能的機理。首先是脈沖激光（50fs）的功率要適中，過低的功率（3W/cm-2）無法引起光化學反應(yīng)，而過高的功率（100W/cm-2）又會導致樣品降解（圖2a）。其次，在正己烷、水、和甲苯中，只有能引起量子產(chǎn)率增加的現(xiàn)象（圖2b），如果Ag2S量子點不含有Ag納米粒，也不會產(chǎn)生此現(xiàn)象（圖2c），后，脈沖間隔為50fs的條件下產(chǎn)生的結(jié)果。而持續(xù)照射的激光不引起任何變化甚至導致熒光減弱（圖2d）。基于以上種種結(jié)果，作者給出了對產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能的機理解釋，如下圖2e所示，當用808nm的飛秒脈沖激光照射時，Ag納米粒子雙光子吸收后會誘導產(chǎn)生高的自由電子密度，從而引起Ag粒子的庫侖爆炸，產(chǎn)生高反應(yīng)活性的Ag+，并與CHCl3反應(yīng)生成AgCl，附著在Ag2S上形成保護殼，低帶隙的Ag2S（0.9ev）表面覆蓋著的高帶隙（5.13ev）無機化合物AgCl保護層可大大減少溶質(zhì)分子振動活化的非輻射躍遷，并防止淺或深中間能隙態(tài)形成的可促進非輻射去激發(fā)途徑的表面陷阱，從而促進熒光量子產(chǎn)率激增。

圖2：a）飛秒激光不同功率激發(fā)下的時間-熒光密度演化曲線（50fs）；b）不同溶劑條件下照射時間-熒光密度演化曲線；c）含有與不含Ag納米粒子的時間-熒光密度演化曲線；d）50fs、100fs、200fs、500fs以及持續(xù)照射條件下的時間-熒光密度曲線；e）可能的機理解釋示意圖

隨后作者進行了動物成像實驗，作者首先在Ag2S表面修飾PEG鏈并和傳統(tǒng)的Ag2S對比了熒光壽命（圖3a），為了證明“超亮點“的優(yōu)異發(fā)光性能，作者選取了單壁碳納米管、稀土摻雜材料以及傳統(tǒng)的Ag2S量子點進行了動物成像實驗，如圖3b所示，在任何激發(fā)功率條件下，”超亮點“的發(fā)光性能，憑借于此，其信噪比是所有實驗組中的（圖3c&d）。小鼠左后肢血管成像進一步證實了該材料的優(yōu)異性能，如下圖3f，兩只小鼠左后肢分別注射傳統(tǒng)Ag2S（左側(cè)）和”超亮點“（右側(cè)）后立即成像，15s后可以看到血管亮度有明顯差異，通過扣除背景熒光獲得凈信號圖像（圖3g），同時除以背景信號值獲得信噪比對比圖（圖3h），兩者均顯示出”超亮點“在提升信噪比方面具有更好的效果，對大隱動脈處的凈信號（圖3i）和信號-背景分布定量結(jié)果（圖3j）也顯示出相比于傳統(tǒng)Ag2S量子點，作者開發(fā)的新型Ag2S量子點將凈信號提升了60%，信噪比提升了90%。

圖3：a）PEG化傳統(tǒng)Ag2S量子點與“超亮點的近紅外熒光衰減曲線；b）不同近紅外熒光材料小鼠成像對比圖；c）激光功率-信噪比曲線；d&e）不同功率下小鼠成像對比圖和激光功率-信噪比曲線；f）兩只小鼠靜脈注射Ag2S點(左圖)和”超亮點“(右圖)前后15s的NIR-Ⅱ熒光圖像；g）凈信號圖像（由圖f中底部圖像扣除圖f中上方背景圖像得到）；h）信噪比對比圖(由圖f中底部圖像除以f中上方背景圖像得到)；i）& j）分別為在圖g和h中白色虛線所劃的大隱動脈的凈信號與信噪比對比圖。

后，作者對所開發(fā)的新型Ag2S量子點進行了生物安全性實驗。作者對小鼠尾靜脈注射了總量為0.5µg（~0.5mg/Kg）的Ag2S量子點，該劑量比傳統(tǒng)Ag2S量子點的用量（6.6mg/Kg）少了一個數(shù)量級，這種成本節(jié)約型和低毒性的探針為未來的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用打開了新的大門。小鼠全身成像后發(fā)現(xiàn)量子點大多數(shù)聚集在肝臟之中（圖4a），此外脾臟和心臟也有少許攝?。▓D4b & c）,此外在小鼠的進食量、體重和體溫方面，進行連續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)無明顯變化（圖4d & e & f）。生化指標方面，作者分別測量了谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清堿性磷酸酶(ALP)、肌酸酐和膽紅素的第1和28天的含量變化，結(jié)果顯示無明顯指標改變，證明了作者所開發(fā)的新型Ag2S量子點在低劑量下的生物安全性。作者認為這是一個很有希望的結(jié)果，需要指出的是，新型Ag2S“超亮點“的臨床轉(zhuǎn)化需要進一步的毒性實驗，包括研究大耐受劑量、清除途徑以及對生理、代謝、行為和認知的影響，這個過程將會是漫長的，但該研究結(jié)果可能為未來的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)并為其他研究人員帶來新的研究思路。

圖4：a）注射“超亮點“后不同時間點的NIR-Ⅱ成像圖；b）肝臟、脾臟、心臟和股動脈熒光強度-時間分布曲線；c）肝臟、脾臟、心臟與肺的NIR-Ⅱ與光學成像圖；d）、e）和f）分別為對照組與實驗組小鼠兩周內(nèi)進食量、體重和體溫變化曲線；g）、h）、I）、j）和k）分別為實驗組小鼠第1和28天的ALT、ALP、AST、肌酸酐和膽紅素的含量變化。

參考文獻

Santos H D A, Gutiérrez I Z, Shen Y, et al. Ultrafast photochemistry produces superbright short-wave infrared dots for low-dose in vivo imaging[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-12.

?? ?? ?? 

紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

?? ?? ??

 恒光智影

       上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)的紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

      與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學、神經(jīng)學、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

      同時，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。