本文要點(diǎn)：對(duì)于一些腫瘤組織和細(xì)胞，低氧的微環(huán)境賦予癌細(xì)胞對(duì)癌癥化療和放療更高的抵抗力，已知低氧程度與腫瘤標(biāo)志物硝基還原酶(NTR)的表達(dá)直接相關(guān)。但是目前現(xiàn)有的大多數(shù)NTR熒光探針的靈敏度仍然不足以檢測(cè)普通生物系統(tǒng)中痕量的NTR。而且，臨床上手術(shù)切除腫瘤是治療癌癥的有效方法，但是，腫瘤邊緣的精確描繪仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

第二近紅外窗口(NIR-II，1000–1700nm)中的熒光成像顯示出較少的光散射以及在活組織中可忽略的背景自熒光，從而導(dǎo)致更深的穿透深度和更高的時(shí)空分辨率。因此，非常需要開發(fā)近紅外II區(qū)的靈敏的NTR熒光開-關(guān)探針，以精確描繪腫瘤邊緣。作者報(bào)道了一種新型的用于腫瘤成像的硝基還原酶激活的近紅外熒光探針RHC-NO2。該探針可以發(fā)射900–1300納米范圍內(nèi)的熒光，并靶向NTR過(guò)表達(dá)的低氧腫瘤，雖然探針本身顯示的熒光可以忽略不計(jì)；然而，在與NTR反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生了大大增強(qiáng)的近紅外熒光信號(hào)，檢測(cè)限低至5.9ng/mL，比現(xiàn)有的NTR近紅外二區(qū)（NIR-II）的熒光開-關(guān)探針低一個(gè)數(shù)量級(jí)左右(約50 ng/mL) 。RHC-NO2探針的高靈敏度使得通過(guò)檢測(cè)低氧腫瘤中的NTR來(lái)精確地對(duì)腫瘤邊緣成像成為可能，并且這種潛力已經(jīng)被荷瘤小鼠模型的體內(nèi)成像所證明。因此，作者認(rèn)為該探針可能為腫瘤邊緣的診斷研究提供一種方便的方法。

首先，作者使用氫化羅丹明聚甲川框架設(shè)計(jì)了發(fā)射峰在921 nm的RHC-NO2探針，該探針使用一個(gè)硝基作為NTR特異性識(shí)別部分以及熒光猝滅劑。當(dāng)探針與NTR（硝基還原酶）反應(yīng)時(shí)，硝基被還原成氨基，921 nm處的熒光被相應(yīng)地恢復(fù)(方案1)。

方案1:  用于NTR（硝基還原酶）檢測(cè)的RHC-NO2的傳感機(jī)制。

在 p H 7.4的PBS中測(cè)得有和沒有NTR（硝基還原酶）的探針的吸收光譜 。如圖1A所示，探針RHC-NO2在677 nm處顯示出吸收，添加NTR導(dǎo)致在868 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，這可能歸因于反應(yīng)產(chǎn)物RHC-NH2的形成。圖1B描述了有和沒有NTR的RHC-NO2的發(fā)射光譜，盡管探針本身由于硝基的猝滅作用沒有熒光 (量子產(chǎn)率Ф< 0.01%)，但與NTR的反應(yīng)使其在921 nm產(chǎn)生強(qiáng)熒光(約14倍增強(qiáng))。這些結(jié)果表明探針與NTR反應(yīng)時(shí)可能產(chǎn)生RHC-NH2。

圖1：RHC-NO2(10μM)與NTR(10μg/mL)在含有10%胎牛血清(FBS)的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中存在NADH (200 μM)的情況下反應(yīng)前(a)和反應(yīng)后(b)的吸收(A)和發(fā)射(B)光譜。

在優(yōu)化的條件下(200 μM NADH，含10% FBS的pH 7.4的PBS中，37℃下反應(yīng)1 h)，RHC-NO2在不同濃度NTR下的熒光響應(yīng)如圖2A和B所示，表明921 nm處的熒光強(qiáng)度隨著NTR的增加而逐漸增加。在1-10 μg/mL范圍內(nèi)，△F和NTR的濃度有很好的線性關(guān)系，方程表示為：△F=1657×[C(μg/mL)]-730(R=0.004)，檢測(cè)限低至5.9ng/mL，其中△F是在921 nm處有和沒有NTR的RHC-NO2的熒光強(qiáng)度之差。這些觀察結(jié)果表明，通過(guò)在近紅外窗口中檢測(cè)痕量濃度的NTR，RHC-NO2可用于體內(nèi)成像。為了深入了解探針的選擇性，在存在各種潛在干擾物質(zhì)的情況下測(cè)試了熒光響應(yīng)。如圖2C所示，在測(cè)試的物質(zhì)中沒有檢測(cè)到顯著的熒光響應(yīng)，被測(cè)試物質(zhì)包括無(wú)機(jī)鹽(Na2S、氯化鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、KCl、氯化鎂、氯化鋅)、維生素C、葡萄糖、活性氧(H2O2，N a O C l，N a N O2，·OH, ONOO-)和生物硫醇(半胱氨酸、谷胱甘肽)。相比之下，NTR的加入導(dǎo)致顯著的熒光增加，表明即使在復(fù)雜的生物環(huán)境中，RHC-NO2也表現(xiàn)出對(duì)NTR的高選擇性。

圖2：(A)RHC-NO2(10 μM)對(duì)不同濃度NTR(0–10 μg/mL)的熒光響應(yīng)。(B) △F對(duì)NTR濃度的線性擬合曲線

(C)RHC-NO2對(duì)各種物質(zhì)(從1到18)的熒光響應(yīng):空白、半胱氨酸(1 mM)、谷胱甘肽(1 mM)、Na2S (100 μM)、維生素C (1 mM)、H2O2(100 μM)、NaOH(100 μ M)、NaNO2 (100 μ M)、·OH (100μM)、Ca2+(2 mM)、Cu2+(100 μM)、Fe2+(100 μ M)、葡萄糖(10 mM)、K+(150 mM)、Mg2+(2 mM)、Zn2+(100 μ M)、ONOO-(200 μ M)，NTR (10 μg·mL-1).

最后，作者將RHC-NO2探針應(yīng)用于活體動(dòng)物腫瘤的近紅外熒光成像。在該實(shí)驗(yàn)中，選擇攜帶皮下A549腫瘤的雌性BALB/c裸鼠作為模型，探針RHC-NO2靜脈注射入A549荷瘤小鼠。從圖3可以看出，在注射約12小時(shí)后，腫瘤中的熒光強(qiáng)度逐漸增加，并且檢測(cè)到的NIR-II信號(hào)。然后，熒光隨時(shí)間減少。最重要的是，注射4小時(shí)后腫瘤與周圍的正常組織變得可區(qū)分，并且腫瘤邊界保持清晰直到約24小時(shí)。值得注意的是，在注射探針后，除腫瘤區(qū)域外，在小鼠身體的其他部位也觀察到熒光，這可能歸因于探針通過(guò)肝臟和腎臟的代謝(這種代謝途徑在先前報(bào)道的文獻(xiàn)中非常常見)。此外，注射24小時(shí)后，腫瘤中的熒光保持明亮，而其他器官中的熒光變得相當(dāng)弱。因此，可以選擇24 h作為A549腫瘤熒光成像和鑒定的時(shí)間點(diǎn)。這些結(jié)果證明了RHC-NO2在生物成像中描繪腫瘤邊緣的能力。

圖3：A549荷瘤小鼠(n = 3)尾靜脈注射RHC-NO2(200 μL，500 μ M)后的代表性NIR-II圖像

解剖小鼠以分析探針在主要器官和腫瘤中的離體生物分布。發(fā)現(xiàn)在靜脈注射RHC-NO2至A549荷瘤小鼠48小時(shí)后，在解剖的腫瘤、肝臟和腎臟中觀察到NIR-II熒光(圖4)。這可能是因?yàn)楦文懴到y(tǒng)和腎臟系統(tǒng)中的這兩個(gè)器官負(fù)責(zé)將探針從體內(nèi)清除。上述結(jié)果表明，RHC-NO2可作為一種潛在的近紅外熒光探針用于癌癥治療。

圖4：在尾靜脈注射RHC-NO2(200 μL ，500 μ M)后，RHC-NO2在A549荷瘤小鼠體內(nèi)的離體生物分布。 

(A)注射RHC-NO2 48小時(shí)后，解剖器官和腫瘤的近紅外-II區(qū)熒光成像

(B)A549荷瘤小鼠(n = 3)的定量熒光強(qiáng)度。

參考文獻(xiàn)

Zhang Xiaofan, et al."Sensitive imaging of tumors using a nitroreductase-activated fluorescence probe in the NIR-II window.." Chemical communications (Cambridge, England) .(2021): doi:10.1039/D1CC03232A.

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