本文要點(diǎn)：第二近紅外（NIR-II）窗口中缺乏具有高量子產(chǎn)率（QYs）和低肝保留的有機(jī)熒光團(tuán)已成為生物成像領(lǐng)域的瓶頸。本文提出通過(guò)將磷酸化熒光染料包封到可生物降解的磷酸鈣納米顆粒中來(lái)解決這些問(wèn)題。首先，NIR-II分子LJ-2P通過(guò)引入兩個(gè)磷酸基團(tuán)來(lái)增加水溶性。同時(shí)，LJ-2P與鈣離子共沉淀，形成LJ-2P納米顆粒（NPs）。與LJ-2P相比，LJ-2P NPs在水溶液中的QYs增加了36.57倍，達(dá)到5.12%。這種獨(dú)te的現(xiàn)象被稱(chēng)為沉淀增強(qiáng)發(fā)射（PEE），其詳細(xì)機(jī)制通過(guò)飛秒瞬態(tài)吸收進(jìn)行探索。結(jié)果表明，LJ-2P與鈣離子的共沉淀改變了微環(huán)境，限制了分子的旋轉(zhuǎn)并減少了水分子的相互作用，特別是激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移。此外，由于對(duì)pH敏感，80%以上的LJ-2P NPs24小時(shí)內(nèi)在肝臟被代謝?；趦?yōu)異的光學(xué)性能和良好的生物相容性，實(shí)現(xiàn)了高對(duì)比度的血管可視化和乳腺腫瘤檢測(cè)。該策略可應(yīng)用于其他NIR-II熒光團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)高QYs和低肝臟保留。

背景：截止到目前，已經(jīng)報(bào)道了一系列開(kāi)發(fā)高亮度NIR-II熒光團(tuán)的策略。例如，將熒光團(tuán)與胎牛血清(FBS)結(jié)合形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-熒光團(tuán)復(fù)合體。由于熒光團(tuán)分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限，以及熒光團(tuán)核心與周?chē)肿娱g相互作用減弱，復(fù)合物的QYs通常高于單獨(dú)的熒光團(tuán)。用聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)基團(tuán)修飾熒光團(tuán)也是改善極性溶劑中QYs的有效方法。其他策略如抑制激發(fā)態(tài)的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)，扭曲共軛骨架，以及引入剛性結(jié)構(gòu)也已被報(bào)道。雖然這些策略顯示了良好的效果，但在臨床應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題，如FBS成分復(fù)雜或AIE等分子在肝臟中嚴(yán)重積累。因此，本文合理設(shè)計(jì)了一種具有兩個(gè)磷酸基的D-A-D分子LJ-2P。LJ-2P的磷酸鹽基團(tuán)與鈣離子共沉淀形成LJ-2P NPs。一方面，沉淀產(chǎn)生的微環(huán)境限制了分子運(yùn)動(dòng)和分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，提高了QYs。另一方面，LJ-2P NPs在LJ-2P分子周?chē)纬煽涨?，有效減少了核骨架與水分子的相互作用。此外，通過(guò)引入兩個(gè)磷酸鹽基團(tuán)，提高了分子在水中的溶解度。水溶性分子被包封在對(duì)pH敏感的LJ-2P NPs中，以改善其在肝臟中的長(zhǎng)期積累?？傊?，我們的PEE策略不僅改善了QYs，而且提高了體內(nèi)生物相容性。

研究?jī)?nèi)容：我們選擇了具有較高化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性的苯并[1,2-c:4,5-c’]雙([1,2,5]噻二唑)(BBTD)衍生物作為模型分子。如Figure.1A所示，LJ-2P是從市面上可用的起始材料按照9步路線合成的。這條路線包括了傅克?；外從九悸?lián)反應(yīng)等關(guān)鍵的反應(yīng)。由于BBTD核心在堿性條件下容易分解，因此選擇了氯氧磷進(jìn)行磷酸化。用氯氧磷成功地將兩個(gè)磷酸基引入熒光團(tuán)中，得到理想產(chǎn)物L(fēng)J-2P，不僅提高了水溶性，而且為實(shí)現(xiàn)PEE奠定了基礎(chǔ)。在B3LYP /6-31G(d)水平上使用高斯09程序進(jìn)行密度泛函理論(DFT)計(jì)算，得到LJ-2P分子的zui高占據(jù)分子軌道(HOMO)和zui低未占分子軌道（Figure.1B）。HOMO在芴和BBTD單元上離域，而LUMO主要定位在缺電子的BBTD單元上。帶隙為1.56 eV，窄帶隙有利于NIR-II窗口的強(qiáng)吸收。

Figure 1

采用反向微乳液法構(gòu)建具有高亮度和良好生物相容性的LJ-2P NPs（Figure.2A）。將溶解在Na2HPO4溶液中的LJ-2P分散在環(huán)己烷/聚氧代乙烯 (5)壬基苯基醚中形成P相。將CaCl2溶液分散在環(huán)己烷/聚氧代乙烯（5）壬基苯基醚中形成Ca相。然后將P相加入到Ca相中形成無(wú)定形的CaP沉淀，再用二油酰磷脂酸鈉鹽（DOPA）穩(wěn)定得到LJ-2P NPs核心。透射電子顯微鏡(TEM)顯示，LJ-2P NPs核心的平均直徑為≈5 nm，而動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析測(cè)得的尺寸因水化半徑而略大(≈9 nm，F(xiàn)igure.2B)。進(jìn)一步用DSPE-mPEG2000對(duì)LJ-2P核粒子進(jìn)行封裝，得到LJ-2P核粒子。合成的LJ-2P NPs具有較高的單分散性，TEM測(cè)定其平均粒徑為≈25 nm, DLS測(cè)定其水動(dòng)力直徑為≈44 nm(Figure.2C)。通過(guò)紫外-可見(jiàn)-紅外吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜對(duì)LJ-2P和LJ-2P NPs的光物理性質(zhì)進(jìn)行了表征(Figure.2D)。LJ-2P和LJ-2P NPs在水中的zui大吸收波長(zhǎng)分別為736 nm和773 nm。有趣的是，LJ-2P和LJ-2P NPs都表現(xiàn)出明顯的雙發(fā)射帶。LJ-2P和LJ-2P NPs在943 nm處表現(xiàn)出相似的窄發(fā)射帶，而寬發(fā)射帶分別在1059和1029 nm處。同時(shí)，我們測(cè)量了LJ-2P在FBS、H2O和THF中的QYs和LJ-2P NPs在H2O中的QYs(Figure.2E)。LJ-2P在THF中的QYs高達(dá)17.38%，表明了分子設(shè)計(jì)的*性。而隨著溶劑極性的增加，LJ-2P的QYs在H2O中急劇下降至0.14%。LJ-2P包封到LJ-2P NPs后，分子的亮度明顯恢復(fù)。與LJ-2P在水中相比，QYs增加了36.57倍，達(dá)到5.12%。此外，F(xiàn)BS中LJ-2P的QYs值為3.33%，增強(qiáng)了23倍，而在H2O中只有LJ-2P NPs的2/3。LJ-2P和LJ-2P NPs的光穩(wěn)定性是通過(guò)連續(xù)的激光照射（808 nm, 90 mWcm?2）60min來(lái)評(píng)估的。每10 min記錄熒光強(qiáng)度I/I0的變化(Figure.2F)。光穩(wěn)定性好，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯下降。而ICG對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度在1 h內(nèi)穩(wěn)定下降到接近0，表明ICG已經(jīng)分解。

Figure 2

PEE機(jī)制：直觀地看，PEE可以限制沉淀染料的分子運(yùn)動(dòng)。在此，首先通過(guò)熒光強(qiáng)度測(cè)量來(lái)評(píng)估分子運(yùn)動(dòng)隨溫度升高的變化。當(dāng)溫度從20℃升高到60℃時(shí)，LJ-2P的熒光強(qiáng)度被猝滅了67%，而在80℃時(shí)衰減達(dá)到91%。這表明LJ-2P在較高的溫度下存在劇烈的分子運(yùn)動(dòng)，并且光子衰變的大部分是通過(guò)非輻射途徑發(fā)生的。相比之下，LCP NPs的熒光強(qiáng)度在60℃和80℃時(shí)分別減弱了18%和33%，表明LJ-2P NPs內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)并不激烈。因此，我們認(rèn)為納米顆粒內(nèi)的沉淀劑嚴(yán)格約束了熒光團(tuán)的運(yùn)動(dòng)。Figure.3AB分別為L(zhǎng)J-2P NPs和LJ-2P在780/740 nm激發(fā)下，功率強(qiáng)度為30μW的二維超快TA光譜。三種激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)由LE（局部激發(fā)）和ICT（分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）狀態(tài)之間的構(gòu)象誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移速率（τ1），ICT狀態(tài)發(fā)射（τ2）和LE狀態(tài)發(fā)射（τ3）表征。然后我們提出了LJ-2P和LJ-2P NPs的電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)路徑，如Figure.3C所示。與LJ-2P相比，LJ-2P的磷酸基與鈣離子的結(jié)合限制了分子的旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致LE和ICT態(tài)之間能量屏障更高。因此，LJ-2P NPs的LE狀態(tài)貢獻(xiàn)了更高比例的發(fā)射帶(Figure.2D)。實(shí)驗(yàn)表明，納米粒子的形成進(jìn)一步限制了水與熒光團(tuán)的接觸，削弱了ESPT效應(yīng)，從而引起了PEE現(xiàn)象(Figure.3E)。

Figure 3

體內(nèi)血管和腫瘤成像：作者首先測(cè)試了LJ-2P NPs的腫瘤血管成像能力。用不同的LP過(guò)濾片測(cè)量活小鼠腫瘤血管的NIR-II熒光成像(Figure.4AC)。不同波長(zhǎng)的空間分辨率由微血管的半zui大寬度(FWHM)來(lái)評(píng)價(jià)。同一位置的血管FWHM分別為352 (LP1000 nm)和314 (LP1150 nm)µm(Figure.4BD)。隨著濾光片波長(zhǎng)的增加，出現(xiàn)了一個(gè)更尖銳的峰值(較低的FWHM)。此外，圖像的信噪比隨著LP濾光片波長(zhǎng)的增加而增加。信噪比從LP1000 nm處的2.56增加到LP1150處的3.73。這些結(jié)果證實(shí)了LJ-2P NPs在腫瘤血管成像方面的卓yue性能。接下來(lái)，作者評(píng)估腫瘤部位隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度。如Figure.4EF所示，腫瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增加，在注射后約3 h達(dá)到峰值，腫瘤對(duì)正常組織的平均熒光強(qiáng)度zui高(T /NT = 4.84)。前3小時(shí)內(nèi)的LJ-2P NPs在腫瘤的積累是由于增強(qiáng)的滲透性和保留 (EPR)效應(yīng)。之后，腫瘤部位的熒光信號(hào)減弱，這是由于LJ-2P NPs的清除。最后時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，切除主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腫瘤)進(jìn)行HE染色。LJ-2P NPs無(wú)器官毒性。這些結(jié)果表明，LJ-2P NPs可作為NIR-II腫瘤診斷的熒光團(tuán)。

Figure 4

體內(nèi)代謝：最后，作者研究了LJ-2P NPs在體內(nèi)的代謝。先前的研究表明，低pH可以溶解CaP核，導(dǎo)致NPs解離。X射線證明CaP的主要成分是羥基磷灰石，在酸性條件下表現(xiàn)出較高的溶解速率和較快的降解速率。在體外細(xì)胞水平也觀察到在低pH值下Ca2+的釋放。假設(shè)LJ-2P NPs在體內(nèi)酸性環(huán)境下分解，釋放出水溶性的LJ-2P，促進(jìn)進(jìn)一步代謝（Figure.5A）。為了證明LJ-2P NPs對(duì)pH的敏感性，在pH 5.0、6.0和7.4緩沖液中進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)(Figure.5B)。釋放時(shí)間為30 min時(shí)，LJ-2P NPs的Ca2+累積溶出度分別為8%、10%和80%，pH值分別為7.4、6.0和5.0。隨后，在pH值為7.4的緩沖液中，36 h內(nèi)LJ-2P的NPs溶解率緩慢增加至14%，而在pH值為5.0時(shí)，LJ-2P的NPs溶解率達(dá)到89%。在pH6.0緩沖液中釋放是中等的，36 h釋放43%?；诹己玫捏w外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)估LJ-2P NPs在體內(nèi)的肝保留情況。將LJ-2P NPs (2.5 mg kg -1)通過(guò)尾靜脈靜脈注入裸鼠(n = 6)，并于0.5 h、第1、2、4、6、8、11和14天進(jìn)行全身NIR-II熒光成像，以監(jiān)測(cè)肝臟保留情況(Figure.5C)。熒光強(qiáng)度分析顯示，LJ-2P NPs在1天后代謝80%，第8天幾乎完quan代謝(Figure.5D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LJ-2P NPs的熒光衰減可能是由于LJ-2P的代謝，而不是NPs的解體。我們將LJ-2P通過(guò)尾靜脈全身注射(2.5 mg kg?1)至裸小鼠(n = 6)，并在同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全身NIR-II熒光成像(Figure.5E)。第4天80%的LJ-2P被代謝，14天內(nèi)觀察到幾乎完quan分泌(Figure.5F)。

Figure 5

總結(jié)：綜上所述，作者通過(guò)引入兩個(gè)磷酸基合成了一種新型的水溶性NIR-II分子LJ-2P。提出了一種能顯著提高QYs的PEE策略，并詳細(xì)探討了PEE的具體機(jī)制，為今后提高QYs的工作提供了啟示。此外，LJ-2P NPs在肝臟中的保留時(shí)間較短。由于LJ-2P NPs具有優(yōu)異的光學(xué)性能和生物相容性，在血管和腫瘤成像中獲得了較高的腫瘤與正常組織的比例。PEE策略也可應(yīng)用于其他NIR-II熒光團(tuán)，以擴(kuò)展生物應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

DOI: 10.1002/smll.202204153

?? ?? ??

近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

?? ?? ??

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專(zhuān)注于近紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

          與基于可見(jiàn)光波長(zhǎng)的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)、心血管、藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

          同時(shí)，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過(guò)15種探針，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。