本文要點(diǎn)：高空間分辨率、低背景和深層組織穿透力使近紅外II（NIR-II）熒光成像成為體內(nèi)觀察和測(cè)量的最關(guān)鍵工具之一。然而，合成NIR-II熒光團(tuán)相對(duì)較短的保留時(shí)間和潛在的毒性限制了其長期應(yīng)用。本文報(bào)告了紅外熒光蛋白（iRFP）作為體外和體內(nèi)NIR-II探針的使用，允許長時(shí)間的連續(xù)成像（長達(dá)15個(gè)月）。作為一個(gè)代表性的例子，將iRFP713敲入小鼠基因組以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因模型，允許探針在時(shí)間和/或空間表達(dá)控制。為了證明其在真正的診斷環(huán)境中的可行性，采用了兩種肝臟再生模型，并成功跟蹤了一周的過程。性能和監(jiān)測(cè)效果與μCT相當(dāng)，優(yōu)于吲哚菁綠染料。盡管胰腺的位置很深，但也能有效地觀察到生理和病理?xiàng)l件下的胰腺。這些結(jié)果表明，iRFP輔助的NIR-II熒光系統(tǒng)適用于監(jiān)測(cè)各種組織和體內(nèi)生物過程，提供了一個(gè)強(qiáng)大的wu創(chuàng)長期成像平臺(tái)。

背景：熒光成像是在活體結(jié)構(gòu)和功能研究中應(yīng)用zui廣泛的技術(shù)之一。使用第二近紅外區(qū)域(NIR-II, 900-1880nm)成像能夠以令人印象深刻的清晰度直接可視化和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)深層生物結(jié)構(gòu)和過程。迄今為止，稀土摻雜納米顆粒(RENPs)，量子點(diǎn)(QDs)和某些有機(jī)熒光染料已被開發(fā)用于多功能生物醫(yī)學(xué)成像中的NIR-II熒光探針。然而，由于它們是化學(xué)合成的，這些探針受到嚴(yán)重的限制，包括它們?cè)谏到y(tǒng)中bu可再生，并可能存在潛在的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞分裂過程中，這種探針在兩個(gè)子細(xì)胞之間的分割將導(dǎo)致信號(hào)衰減，導(dǎo)致在多次細(xì)胞復(fù)制后探針不再被檢測(cè)到。此外，合成探針可以通過體內(nèi)的生物過程快速分解或消除，根據(jù)類型，外源性熒光探針可能表現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞毒性。因此，這些探頭不適用于長時(shí)間成像。作為一種替代且更具生物相容性的選擇，熒光蛋白（FPs）在長期監(jiān)測(cè)中比化學(xué)合成探針具有很大的優(yōu)勢(shì)。已報(bào)道了多條近紅外FP線。其中，紅外熒光蛋白（iRFP）系列，包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713和iRFP720，在近紅外波長下具有發(fā)射和激發(fā)光譜。iRFP是杜鵑假單胞菌細(xì)菌植物色素的工程版本，可實(shí)現(xiàn)wu創(chuàng)和長期體內(nèi)可視化。然而，到目前為止，只有NIR-I區(qū)域被開發(fā)。為了探索iRFP在NIR-II區(qū)域的應(yīng)用，本文研究證明了iRFP713通過非峰值熒光發(fā)射進(jìn)行NIR-II生物成像具有較高的時(shí)間和空間分辨率，具有長期監(jiān)測(cè)能力，可作為各種內(nèi)部生物過程成像的強(qiáng)大平臺(tái)。

研究內(nèi)容：

圖1

2、iRFP713的NIR-II體內(nèi)成像

本文采用基于CRISPR/ Cas9的基因組編輯技術(shù)將iRFP713基因敲入小鼠內(nèi)源性Rosa26位點(diǎn)(iRFP713flox/flox)。具體來說，是將一個(gè)lox-stop-lox (LSL)元件放置在iRFP713前面，跟隨CAG啟動(dòng)子，防止iRFP713的表達(dá)，除非引入Cre重組酶去除停止盒?；蚍中头治鲎C實(shí)成功構(gòu)建了所需的轉(zhuǎn)基因小鼠。在與不同組織特異性Cre系的iRFP713flox/flox小鼠雜交后，通過Cre介導(dǎo)的重組，位于兩個(gè)lox位點(diǎn)兩側(cè)的停止元件可以被刪除或倒置，導(dǎo)致iRFP713僅在表達(dá)Cre的組織中被激活。因此，使用該技術(shù)，本文建立一個(gè)組織特異性表達(dá)irfp713的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖2a)。為了評(píng)估其成像能力，本文生成了一個(gè)全身表達(dá)iRFP713的小鼠(iRFP713flox/flox;Ella-Cre)通過將iRFP713flox/flox鼠標(biāo)與EIIa-Cre系雜交。在確認(rèn)對(duì)小鼠沒有明顯的副作用或健康問題后，我們檢查了所需后代的熒光特性。與對(duì)照組(iRFP713flox/flox)相比，iRFP713flox/flox；EIIa-Cre小鼠的整個(gè)身體表現(xiàn)出明亮的NIR-II熒光（圖2b）。進(jìn)一步檢測(cè)了表達(dá)iRFP713的小鼠在出生后1、3和8周甚至15個(gè)月的熒光。結(jié)果表明，通過NIR-II成像，可以在所有這些時(shí)間點(diǎn)清楚地檢測(cè)到iRFP713熒光信號(hào)（圖2bc）。此外，我們能夠區(qū)分某些器官的邊界，例如肝臟，并從不同角度觀察內(nèi)部組織的細(xì)節(jié)（圖2c）。此外，我們對(duì)離體器官進(jìn)行了體外NIR-II熒光成像（圖2d）。不同器官的熒光強(qiáng)度各不相同，從腎臟和胃的熒光強(qiáng)度zui低，心臟、肺和胰腺的熒光強(qiáng)度較高，肝臟中熒光強(qiáng)度zui高（圖2de）。這些數(shù)據(jù)共同表明，基于iRFP713的NIR-II熒光成像可以作為wu創(chuàng)組織觀察的平臺(tái)。

圖2

3、體內(nèi)肝臟再生實(shí)時(shí)追蹤

為了測(cè)試我們的成像系統(tǒng)是否具有長期觀察活體生物過程的潛力，我們使用肝臟再生作為監(jiān)測(cè)模型。為了防止肝臟以外的非靶組織對(duì)iRFP713熒光的干擾，比如在表達(dá)iRFP713的全身小鼠中，我們認(rèn)為開發(fā)一種表達(dá)iRFP713的肝細(xì)胞特異性動(dòng)物更合適。為此，我們將iRFP713flox/flox小鼠與Alb-Cre系雜交，其中Cre重組酶受Alb啟動(dòng)子控制，使Cre只在肝細(xì)胞中表達(dá)(圖3a)。與預(yù)期的一樣，幼(8周)和大(15個(gè)月)的iRFP713flox/flox; Alb-Cre小鼠的肝臟都可以通過NIR-II熒光清晰可見，而對(duì)照組沒有顯示任何熒光（圖3b）。接下來，我們?cè)趇RFP713flox/flox;Alb-Cre小鼠中建立了部分肝切除術(shù)(PHX)模型以監(jiān)測(cè)肝臟再生過程。在該模型中，大約三分之二的肝臟被手術(shù)切除，然后肝臟在7 - 10天內(nèi)通過肝細(xì)胞的增殖恢復(fù)到原來的質(zhì)量(圖3c)。如圖3d所示，當(dāng)從右側(cè)觀察時(shí)，NIR-II熒光成像能夠清楚地分辨PHX小鼠中包含三個(gè)部分（中葉，左葉和右葉）的正常“冠狀"形狀，并能看到切除中葉和左葉后殘余肝臟。熒光的面積和強(qiáng)度從第1天到第7天逐漸增加，肝臟相應(yīng)恢復(fù)和再生。為了提供參考標(biāo)準(zhǔn)，我們還通過造影劑增強(qiáng)μCT定量測(cè)量了殘余肝體積，這在臨床環(huán)境中通常用于肝臟診斷μCT分析顯示，切除術(shù)后肝容量顯著增加，第5天和第7天分別為191.0%±35.0%和218.3%±53.8%（圖3d）。然后，我們估計(jì)了μCT肝臟測(cè)量數(shù)據(jù)與iRFP713輔助NIR-II熒光成像的相關(guān)性。iRFP713熒光面積數(shù)據(jù)與μCT測(cè)量的體積（R2= 0.9595，p< 0.01）（圖3d），表明我們的系統(tǒng)在小鼠肝臟可視化方面可與經(jīng)典的μCT相媲美。吲哚菁綠（ICG）是一種臨床批準(zhǔn)的安全熒光染料，用于肝臟研究和近紅外熒光成像。為了比較iRFP713和這種染料的性能，我們?cè)赑HX模型中使用ICG進(jìn)行了NIR-II成像。與iRFP713不同，我們必須在每次觀察之前通過尾靜脈單獨(dú)給予ICG。ICG輔助成像沒有提供清晰的肝臟與其他組織對(duì)比，因?yàn)槿玖媳谎杆俅x并且無法特異性地積聚在肝臟中（圖3e）。我們還采用了經(jīng)典的化學(xué)肝損傷模型，對(duì)乙酰氨基酚（APAP）驅(qū)動(dòng)的肝臟再生，評(píng)估iRFP713和ICG的可視化功能。iRFP713輔助成像顯示，由于APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，肝臟熒光強(qiáng)度在第1天下降了62.8%（圖3f），但在第2天和第3天分別增加了17.4%和35.1%（圖3f）。這種“先跌后升"的現(xiàn)象與急性肝損傷的病理過程一致，急性肝損傷表現(xiàn)出明顯的損傷和消退階段。然而，在基于ICG的成像中沒有觀察到顯著變化（圖3f）。

圖3

4、胰腺的wu創(chuàng)長期可視化

胰腺作為位于深部的器官之一，兼具內(nèi)分泌和外分泌功能，與糖尿病和胰腺炎等常見疾病過程明顯相關(guān)。為了測(cè)試我們的系統(tǒng)如何在這種深層組織中工作，我們將iRFP713flox/flox與Pdx1-Cre品系雜交，生成胰腺特異性iRFP713表達(dá)的小鼠 (iRFP713flox/flox;Pdx1-Cre)（圖4a）。在NIR-II成像下，無論小鼠是年輕（8周）還是老年（15個(gè)月），胰腺中的熒光清晰，而它們的對(duì)照組則缺乏任何明顯的NIR-II熒光信號(hào)（圖4b）。然后，我們通過在剖腹手術(shù)期間在充滿液體的胰腺和分離的胰腺中檢測(cè)來自胰腺內(nèi)部的熒光信號(hào)，在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中確認(rèn)了胰腺特異性iRFP713熒光(圖4c)。為了驗(yàn)證病理?xiàng)l件下的胰腺成像能力，我們首先使用鏈脲佐菌素（STZ）生成糖尿病模型。在這里，iRFP713fiox/flox;Pdx1-Cre小鼠被施予多種低劑量的STZ以誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞衰竭和死亡。然后，我們?cè)诓煌臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了NIR-II熒光成像。如圖4d所示，胰腺的熒光信號(hào)在STZ注射后第1、3、5和7天略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4d）。我們認(rèn)為這主要是因?yàn)檎麄€(gè)胰腺中表達(dá)iRFP713的β細(xì)胞百分比低。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，我們給小鼠施用蔚藍(lán)素以誘導(dǎo)急性胰腺炎（圖4e）。在該模型中，胰腺腺泡細(xì)胞（主要的表達(dá)iRFP713的細(xì)胞）是天青素的靶標(biāo)。影像學(xué)結(jié)果顯示，腹腔注射天青素1天后，iRFP713熒光顯著下降，隨后隨著胰腺從急性胰腺炎中恢復(fù)，熒光顯著升高（圖4f）。這些數(shù)據(jù)表明，胰腺特異性iRFP713的NIR-II成像可用于監(jiān)測(cè)生理和病理?xiàng)l件下的胰腺。

圖4

總結(jié)：通過使用蛋白質(zhì)iRFP713作為探針，我們開發(fā)了一種生物相容性和可再生體內(nèi)NIR-II監(jiān)測(cè)方法，具有深度穿透性和高成像對(duì)比度。該平臺(tái)不僅適用于準(zhǔn)備組織特異性表達(dá)時(shí)的單組織觀察，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)任何器官的長期可視化。我們相信，該平臺(tái)可以作為長期監(jiān)測(cè)許多活體生物過程的有力工具。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1038/s41467-022-34274-w

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