本文要點：利用光學技術對早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進行無chuang分析時，主要基于傳統(tǒng)光學顯微鏡元件和圖像傳感器，采集和分析的光的波長范圍在400-900 nm范圍內。本文比較了使用可見光和近紅外范圍(VISNIR) 400-1000 nm和短波紅外范圍(SWIR) 900-1700 nm的無chuang光學方法。在這些波長范圍內測量斑馬魚組織的透射光譜，然后根據(jù)VISNIR和SWIR的數(shù)據(jù)計算血管圖、心率和血流速度。SWIR中記錄了更高的色素圖案透明度，而在此范圍內的心臟和血管檢測質量不低于VISNIR。所獲得的結果表明，SWIR成像用于監(jiān)測斑馬魚胚胎和幼蟲的心臟功能和血流動力學分析的效率更高，并表明與其他受色素模式發(fā)育限制的光學技術相比，SWIR成像可支持更長的實驗計劃。

背景：斑馬魚(Danio Rerio)是一種小型鯉科魚類，是研究脊椎動物包括人類疾病各種過程的蕞常見的模式生物之一。在過去的幾十年里，由于其基因組中存在人類疾病基因和胚胎的光學透明度，斑馬魚一直被積極地用于模擬心血管病理。光學方法是對早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進行非侵入性研究的蕞常見方法。在斑馬魚模型中，這些技術被用作檢查先天性心臟病、心肌病以及各種因素對心血管系統(tǒng)功能的影響的工具。此外，透明的斑馬魚胚胎可以用于研究心血管表型以及血流動力學與癌細胞遷移能力的關系。

如今，光學相干層析成像使斑馬魚內部的微米分辨率可視化成為可能。當其與光聲學、血管造影術或其他成像手段相結合時，是識別和研究特定組織的可靠工具。共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡提供了斑馬魚心臟和血管的更詳細的結構，但需要長期掃描和血細胞標記。染料的熒光可以進行準確的高對比度心血管成像。沒有這兩種顯微鏡及染料，就需要大量的圖像分割和分析算法。無標簽且經(jīng)濟實惠的心跳測量和血管測繪的光學方法主要基于時差分析，也就是說在顯微鏡明場圖像中跟蹤與血液脈動相關的時間變化。

光學技術在可見光下的一個重要限制，來自于色素圖案的形成導致的胚胎透明度降低。野生型斑馬魚中黑色素細胞的定位和轉變，將使用光學方法的長期實驗計劃限制在在受精后1-2周。過去開發(fā)了1-苯基-2-硫脲的應用和基因組干預的方法，以達到在更長時間內保持斑馬魚胚胎透明度的目的，但基因組干預或化學試劑的應用可能會影響實驗結果。此外，實驗計劃可能建議只使用野生斑馬魚。因此，允許忽略黑色素細胞的光學方法的發(fā)展，關系到斑馬魚胚胎和魚類胚胎模型的應用。

SWIR(900-1700 nm)的光學技術是克服這一問題的方法之一。該范圍內的光具有減少散射和在生物組織中具有更高穿透深度的優(yōu)點。SWIR相機的上市使多種高靈敏度成像方式成為可能。本文通過實驗證明了斑馬魚組織在SWIR中的光學透明度比在VISNIR中的高，SWIR成像可以更有效地進行典型的心血管成像觀察。

Figure 1

這項研究包括兩個階段(圖1)。第yi個階段的目的是測量斑馬魚組織的光譜特性，并證明SWIR在光學透過率方面比VISNIR具有潛在的優(yōu)勢。在第二階段，我們通過計算血管地圖、心率和血流速度，定量比較了VISNIR和SWIR對心血管系統(tǒng)的表征。

Figure 2

首先是光學透明度測量。圖2a和2b顯示了眼睛、卵黃、肌肉、心臟和耳石的VISNIR(400-900 nm)和SWIR(900-1700 nm)圖像，這些器官具有不同的結構和特性。本文手動選擇與它們相關的區(qū)域(圖2c中的彩色陰影區(qū)域)并標記顏料圖案，以查看其在VISNIR中的弱透明度在SWIR中是否有所不同。通過在顯微鏡照明系統(tǒng)中安裝窄帶濾光片，獲得了15幅斑馬魚麻醉后的光譜圖像，計算了選定器官I(λi)(i=1，2，…，15)和無標本背景B(λi)的平均強度隨波長的變化關系，并計算了T(λi)=I(λi)/B(λi)的透射譜。圖2d顯示了超過5個樣本的平均箱線圖T(λi)。由于圖2d中灰色垂直條紋所示的1450 nm附近的高吸水率，認為該波長帶內的T(λi)的值是不可靠的，因此跳過它。圖2d中顯示的數(shù)據(jù)清楚地表明，在SWIR中，所有斑馬魚器官的光透過率T(λi)增加了1.5-2.5倍。肌肉、卵黃、心臟和色素皮膚在850-1600 nm的整個范圍內始終保持70%-90%的透明度。

Figure 3

接著進行心血管研究，首先是血管成像研究。圖3展示了斑馬魚身體的典型VISNIR和SWIR圖像。一旦原始序列的圖像被匹配，通過視頻毛細血管鏡即可計算血流圖，即通過突出顯示強度變化對應于心臟活動的像素來計算強度變化的二維分布和血管圖像。從VISNIR圖像（上行）中檢測嚴重色素沉著區(qū)域的血管幾乎是不可能的。在圖3所示的個體中，標有黃色的色素圖案覆蓋了大部分的主靜脈和部分節(jié)段動脈，這就導致在重建的血管圖像中沒有這些血管（圖3b上行）。而在SWIR圖像中，該色素是透明的（圖3a下行），因此幾乎不影響SWIR圖像處理算法的血流檢測能力。從SWIR系列圖像重建的血管圖顯示了更詳細的血管結構，包括那些被色素沉積圖案隱藏的血管（圖3b下行）。

Figure 4

收集8張重疊20%-30%的圖像，計算血管地圖，并將它們拼接成無縫全景圖，在VISNIR和SWIR中獲得整個動物的高分辨率血管圖像(圖4)。在SWIR全景圖(圖4b)中，可以在頭部、身體和尾部看到多條血管，這些血管在VISNIR(圖4a)中是不存在的。同樣，由于SWIR的透明度，魚全身的色素沉著幾乎不會影響光學測量。

Figure 5

其次是心率的測量。心率是心臟功能和整體健康的主要指標。它的測量最直接的方法之一是光體積描記術(PPG)，即跟蹤血液循環(huán)的體積變化。本文在VISNIR和SWIR中實現(xiàn)了這種心率測量方法。本文選擇了心臟區(qū)域(圖5a中用彩色框突出顯示)，并計算了其平均強度的時間依賴性（圖5b）。在減去低頻分量之后，得到可以分析和比較的歸一化PPG信號(圖5c)。實驗表明，VISNIR和SWIR成像都能提供清晰穩(wěn)定的周期性PPG信號。雖然VISNIR中的心跳信號的幅度是VISNIR的4-5倍，形狀更詳細，但這兩種信號都很適合心率測量。在圖6所示的例子中，用VISNIR和SWIR測量的心率分別為161次/分和164次/分。這些值與過往研究中獲得的數(shù)據(jù)接近。

Figure 6

最后是血流速度的測量。血流速度是定量描述心功能和了解心血管血流動力學至關重要的參數(shù)。圖6a顯示了在VISNIR和SWIR中獲取的斑馬魚身體的原始圖像。選擇了大動脈(紅色)和主靜脈(藍色)的區(qū)域(見圖6a和6b)，通過檢測這些血管的中心線并計算每個點的法線，將它們的軌跡轉換為直線，并跟蹤相鄰圖像之間的相對位移，血流速度即可以計算為該位移和50赫茲的幀速率的乘積。在VISNIR中，色素沉著的圖案幾乎wan全覆蓋了大靜脈(見圖6a)。因此，血流速度的檢測和分析只有在短波紅外中才是可行的。圖6b顯示了腹主動脈和主靜脈血流速度的時間依賴關系。腹主動脈和基底靜脈信號的相移、形狀、速度值(VISNIR：576±450μm/s，SWIR：574±510μm/s和564±112μm/s)以及其他特征與用其他方法獲得的數(shù)據(jù)很好地吻合。同時還可以通過簡單的頻率分析從這些信號中提取心率。在圖6所示的例子中，VISNIR為161 bpm，SWIR為164 bpm。這些值與從心臟區(qū)域的PPG信號獲得的值一致(圖5c)。

Table 1

Table 2

表2總結了與在VISNIR和SWIR中對兩種斑馬魚4 dpf胚胎進行的心血管研究相關的量化數(shù)據(jù)。PPG信號的信噪比(SNR)反映了心臟活動測量的可靠性。血管密度被定義為與檢測到的血流的血管相關的像素與樣本占據(jù)的總像素量的比例。表2中的量化數(shù)據(jù)顯示了SWIR心血管研究相對于傳統(tǒng)VISNIR成像的優(yōu)勢。由于斑馬魚器官的透明度和色素沉著，SWIR圖像的處理在血管測繪和血流速度測量方面更具信息量和可靠性。

討論：本文對VISNIR和SWIR成像的評估顯示，SWIR中的斑馬魚組織的光學透過率顯著增加，色素圖案更透明。同時，在此范圍內獲得的圖像的心臟和血管檢測質量不遜于VISNIR。

SWIR成像允許將野生型斑馬魚的成像周期延長2-3周，并放棄遺傳或生化操作以增加組織透明度。這種方法可用于在斑馬魚模型中建立復雜的長期實驗計劃（例如，在研究藥物的藥效學、藥物和異生素的延遲效應和生物蓄積、血液中循環(huán)腫瘤細胞的轉移動力學等）。

斑馬魚是目前生物醫(yī)學實驗中墜受歡迎的魚類。如今，硬骨魚中的一些其他魚類被探索來模擬人類疾病。由于魚類的早期發(fā)育的相似性，SWIR成像很有可能作為非侵入性光學方法，在大多數(shù)硬骨魚的早期發(fā)育階段用于研究其心血管功能和血管造影。

結論:與VISNIR相比，斑馬魚組織及其色素圖案在SWIR中表現(xiàn)出更高的透明度。這一發(fā)現(xiàn)擴大了光學技術用于心血管研究的范圍，如監(jiān)測心臟活動和血流成像。即使在存在色素的情況下，SWIR成像也可以對位于色素后面的血管進行非侵入性測繪和量化。這項研究的結果可能會提高多種光學技術(光體積描記、光學相干斷層掃描、高光譜成像等)的效率，同時這些光學技術被廣泛應用于研究斑馬魚的發(fā)育動力學和紊亂。

參考文獻

Volkov, M.; Machikhin, A.; Bukova, V.; Khokhlov, D.; Burlakov, A.; Krylov, V., Optical transparency and label-free vessel imaging of zebrafish larvae in shortwave infrared range as a tool for prolonged studying of cardiovascular system development. Sci Rep 2022, 12 (1), 20884.

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