本文要點：阿爾茨海默病(AD)是臨床廣泛的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。β 淀粉樣蛋白 (Aβ) 作為AD的典型病理生理學(xué)標(biāo)志物，來源于單體 Aβ 自發(fā)聚集成形成不溶性Aβ原纖維，積聚并沉積在大腦中，從而誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。目前還沒有有效的策略來治療AD的發(fā)生發(fā)展。腦脊液的診斷過程具有侵入性（脊髓穿刺），因此不被廣泛接受。相比之下，開發(fā)用于檢測Aβ蛋白的成像探針為AD的早期表征和及時干預(yù)提供了有效策略，如正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描（SPECT）和磁共振成像（MRI）等。然而這些探針具有靈敏度低、成本高、電離輻射和高背景等缺點，因此開發(fā)可激活熒光探針具有重要意義。近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng) - MARS

目前，用于Aβ蛋白的成像熒光探針有硫黃素T（ThT）和硫黃素S（ThS），但他們的發(fā)射波長短（480 nm），血腦屏障（BBB）穿透能力差，限制了它們的體內(nèi)應(yīng)用。此外，雖然有一些可激活的熒光探針用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像，但這些探針的熒光發(fā)射通常位于NIR-I區(qū)(650–900 nm) ，穿透深度淺，信噪比(SNR)低，不適合腦組織成像。因此本文作者開發(fā)了NIR-II區(qū)（900–1700 nm）發(fā)射的可激活熒光探針用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像(圖1)。

圖1. DMP2用于Aβ蛋白的體內(nèi)成像

首先，作者設(shè)計并篩選了一系列Aβ蛋白的特異性NIR-II熒光響應(yīng)探針(D-π-A結(jié)構(gòu))，探針由三部分組成：咔唑或二甲氨基苯為電子供體（D），噻吩橋或雙鍵為π橋，同時提高親脂性（容易透過BBB），以及苯并吲哚鎓作為電子受體（A），合成了熒光探針ECV、DMP1、DMP2和DMP3（圖2a）。隨后，作者評價了探針的光學(xué)性能。溶劑效應(yīng)測試說明ECV發(fā)射位于NIR-I區(qū)，其他三種化合物均處于NIR-II區(qū)（圖2e-h）。Gaussian09W計算進(jìn)一步說明更強(qiáng)的給電子作用能夠增強(qiáng)推拉效應(yīng)，從而產(chǎn)生NIR-II區(qū)的紅移熒光（圖2i）。

圖2. (a) 探針的分子結(jié)構(gòu) (e、f、g、h) ECV、DMP1、DMP2和DMP3探針在不同極性溶劑中的熒光光譜。(i) 探針在水中的HOMO-LUMO能極差。

此外，作者還觀察到這四種探針對粘度有依賴性的熒光變化，所以推斷探針可能發(fā)生了扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT)。TICT效應(yīng)已被用于檢測A β蛋白的熒光探針的構(gòu)建，抑制分子內(nèi)的TICT效應(yīng)能夠提高熒光探針的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率。緊接著，作者測試并篩選了探針對Aβ原纖維的響應(yīng)情況。與Aβ原纖維孵育后，DMP1、DMP2和DMP3的NIR-II熒光分別選擇性的增強(qiáng)了27.0倍、41.8倍和43.1倍，而ECV幾乎無差異（圖3f-h）。熒光增強(qiáng)可能是由于Aβ原纖維介導(dǎo)了探針在光照射情況下從非發(fā)射扭曲的TICT狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邿晒鉁?zhǔn)平面局部激發(fā)(LE)狀態(tài)。相比于商業(yè)探針ThT僅5.1倍的熒光增強(qiáng)，DMP2和DMP3具有更理想的成像對比度?；跓晒獾娘柡徒Y(jié)合法計算DMP2的結(jié)合親和力(Kd)為42.0 nM，與Aβ原纖維具有很好的結(jié)合親和力（圖3i-k）。然后作者使用DMP2測試其與ThT結(jié)合的Aβ原纖維的競爭位移能力，置換率高達(dá)72%(圖3l)。

圖3. (e) 探針與Aβ聚集體結(jié)合后的熒光增強(qiáng)倍數(shù) (f、j、h) 探針在其他潛在干擾物存在時對Aβ聚集體的選擇性研究(1-10：潛在干擾物，離子、氨基酸和牛血清白蛋白等11：Aβ 單體) (i、j、k) PBS溶液中探針的結(jié)合親和力測定 (l) DMP2和ThT探針的競爭置換實驗。

然后，作者使用分子對接軟件模擬了探針與Aβ原纖維之間的相互作用(圖4)，進(jìn)一步說明了DMP2探針具有高選擇性的熒光“off-on"響應(yīng)和與Aβ蛋白的強(qiáng)結(jié)合親和力，在檢測Aβ蛋白方面具有很大前景。

圖4. DMP2與Aβ原纖維的相互作用圖

隨后，作者檢測了DMP2與Aβ蛋白結(jié)合后NIR-II熒光的穿透深度。NIR-II熒光在0.5 cm厚度下的信噪比仍然為20.4，在1.5 cm的厚度上，NIR-II熒光信號仍是可識別的(圖5a-b)。與此同時，作者通過構(gòu)建體外血腦屏障模型（圖5c）測試了DMP2穿透血腦屏障的能力。DMP2的通透性隨孵育時間的增加而增加，120 min后達(dá)到23.8%，比ThT高9.9倍，與FDA批準(zhǔn)的可穿透血腦屏障的藥物替莫唑胺(TMZ)相當(dāng)，說明其其親脂性適合穿透血腦屏障(圖5d)。

圖5. (a、b) DMP2探針在溶液和腦切片中的組織滲透能力研究 (c、d) 體外血腦屏障模型及Transwell室滲透性試驗

在活體測試中作者選用探針DMP2與商業(yè)探針ThS分別對野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的腦組織切片進(jìn)行成像對比，正如預(yù)期的，在DMP2或ThS染色后，在野生型小鼠腦切片中沒有觀察到明顯的熒光。相比之下，在用ThS和DMP2染色后，來自AD模型小鼠的腦切片在大腦皮層和海馬區(qū)域顯示出聚集性熒光，表明DMP2對Aβ蛋白的檢測具有高度特異性。此外，對腦切片中線性靶向區(qū)域熒光強(qiáng)度的定量研究進(jìn)一步說明了DMP2和ThS均可染色Aβ蛋白，但前者的信號更強(qiáng)（圖5 e-f）。

圖5 (e、f)野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的腦組織切片成像

最后在體內(nèi)成像時，作者選用8月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行研究（圖6a）。野生型小鼠在注射DMP2后各個時間點的腦內(nèi)熒光信號均較弱。而AD模型小鼠僅注射后10分鐘就觀察到了明顯的NIR-II熒光信號，且能在腦內(nèi)長時間保留，可用于體內(nèi)實時縱向成像（圖6b）。隨后作者處死小鼠提取腦組織，記錄NIR-II熒光成像，進(jìn)一步證實NIR-II熒光來源于AD小鼠腦組織。同時，共聚焦成像顯示的皮層和海馬部位明顯的熒光信號說明DMP2可以高效高特異性的識別AD模型小鼠的Aβ蛋白，可用于Aβ蛋白的wu創(chuàng)成像，深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展（圖6f）。

圖6 (a) DMP2探針的NIR-II熒光成像示意圖 (b)野生型小鼠和AD模型小鼠的活體腦成像 (f) Aβ單克隆抗體(MOAB)染色后的腦組織切片離體熒光圖像

參考文獻(xiàn)

Miao, J., Miao, M., Jiang, Y., Zhao, M., Li, Q., Zhang, Y., et al. (2023). An Activatable NIR-II Fluorescent Reporter for In Vivo Imaging of Amyloid-beta Plaques. Angew Chem Int Ed Engl, 62(7), e202216351.

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