本文要點：作者設(shè)計并研制了 D-π-A-π-D 型有機(jī)小分子熒光團(tuán) CED，并將其與 DSPE-mPEG2000 包裹在水溶性納米粒子中，合成了一種明亮的 NIR-II 納米熒光團(tuán)(CED NPs)。CED NPs 可安全、靈敏、快速地用于體內(nèi)熒光成像。近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng)

生物學(xué)實驗表明，小鼠尾靜脈注射后可立即檢測到體內(nèi)強(qiáng)熒光信號。在裸鼠皮下腫瘤模型中，CED NPs 可富集于裸鼠腫瘤部位，并通過血液循環(huán)和 EPR 效應(yīng)呈現(xiàn)腫瘤輪廓。在轉(zhuǎn)移性裸鼠模型中，CED NPs 可標(biāo)記裸鼠受癌細(xì)胞侵襲的淋巴結(jié)，并通過熒光成像指導(dǎo)手術(shù)切除(圖 1)。

圖1. CED NPs制備及動物實驗示意圖

圖2. CED的特性

為了使CED 分子具有更好的生物應(yīng)用，將CED 分子中的醛基與 NH2-PEG 發(fā)生希夫堿反應(yīng)，通過引入 PEG 基團(tuán)提高了 CED 分子的水溶性（圖 2e）。為了避免聚集熒光淬滅和減弱 CED 分子之間的相互作用，CED 被DSPE- mPEG2000 包封，制備成納米顆粒（CED NPs）。通過改進(jìn)和表征 CED 的疏水性，認(rèn)為 CED NPs 的形態(tài)、粒度和水溶性可以滿足下一步實驗的要求。

圖3. CED NPs的熒光特性

在CED NPs水溶液中，通過紫外-可見-近紅外分光光度計法測得CED NPs的zui大吸收峰在725 nm處（圖3a）。CED NPs水溶液的zui大熒光發(fā)射峰可達(dá)1025 nm(圖3b)。圖3c顯示了CED NPs在3種溶液中均表現(xiàn)出良好的熒光穩(wěn)定性。使用 IR-26 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計算了 CED NPs 的熒光量子產(chǎn)率 (QY)，計算得到 QYIR-26 =0.50%，QY CED NPs=1.15%。

圖4. CED NPs的細(xì)胞毒性特征

為滿足生物安全要求，采用 MTT 法對 CED NPs 的毒性進(jìn)行表征。檢測3T3細(xì)胞（圖4a） 929 細(xì)胞（圖4b）和 4T1 癌細(xì)胞(圖4c)的毒性，實驗結(jié)果表明，CED NPs 對正常細(xì)胞的毒性略強(qiáng)于癌細(xì)胞，推測胞吐和癌細(xì)胞的增殖能力可能會干擾毒性實驗。作者還通過細(xì)胞活力染色實驗驗證了CED NPs 對正常細(xì)胞3T3的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示不同濃度下的活細(xì)胞數(shù)差異不大，表明 CED NPs 毒性較小。綜上所述，CED NPs 具有良好的生物安全性，可進(jìn)一步用于體內(nèi)實驗。

圖5. CED NPs體內(nèi)熒光特性的表征

尾靜脈注射CED NPs后，小鼠體內(nèi)可立即觀察到熒光信號(圖5a)，在約5分鐘內(nèi)可清楚地觀察到小鼠的主要血管和一些淋巴結(jié)。對照組注射DSPE-mPEG2000后，成像系統(tǒng)未觀察到熒光(圖 5b)。注射CED NPs 24h后，解剖正常裸鼠，對主要器官進(jìn)行熒光成像，結(jié)果熒光信號主要集中在肝臟，在脾臟也有少量信號，心臟、肺或腎臟中無熒光信號。通過組織切片可見，CED NPs 注射 24 h 后，裸鼠主要器官未見明顯異常、炎癥或病變。因此，CED NPs 具有良好的生物相容性，且對裸鼠臟器無損傷。

圖6. 裸鼠轉(zhuǎn)移性腫瘤的熒光特性

為實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤顯像，本研究選擇免疫缺陷的裸鼠為機(jī)體，4T1 細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞來源，建立轉(zhuǎn)移性腫瘤模型。CED NPs 可通過血液循環(huán)被動地靶向轉(zhuǎn)移性腫瘤裸鼠中被癌細(xì)胞侵襲的淋巴結(jié)，從而點亮全身更多的淋巴結(jié)。因此，CED NPs 可用于標(biāo)記裸鼠中腫脹的淋巴結(jié)，用于檢測轉(zhuǎn)移性腫瘤。

在本研究中，作者使用D-A-D結(jié)構(gòu)作為有機(jī)小分子探針的基本骨架，引入EDOT作為受體和供體之間的π-鍵延伸共軛結(jié)構(gòu)，并設(shè)計和合成了具有更大共軛結(jié)構(gòu)的小分子熒光團(tuán)。為了避免共軛分子之間的相互作用導(dǎo)致熒光猝滅，研究者在共軛分子的主鏈上引入長鏈烷基作為弱分子間力的屏蔽單元。其次，為了提高CED分子的水溶性，減少聚集熒光的影響，我們用脂質(zhì)體包封了它。CED納米粒子在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光特性和生物安全性，可以清晰靈敏地標(biāo)記皮下荷瘤裸鼠的腫瘤位置和輪廓，并可用于標(biāo)記無定向腫瘤裸鼠的腫大淋巴結(jié)，為熒光成像指導(dǎo)臨床手術(shù)提供了清晰的視覺視角。

總之，NIR-II有機(jī)小分子熒光探針是一種非常有前途的造影劑。利用有機(jī)分子結(jié)構(gòu)的易調(diào)諧特性，不斷改進(jìn)小分子探針和供體-受體組合的結(jié)構(gòu)，設(shè)計和合成更好的熒光基團(tuán)，加速臨床轉(zhuǎn)化，從而極大地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)成像的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

Yuan, L.; Su, Y.; Zhang, R.; Gao, J.; Yu, B.; Cong, H.; Shen, Y., NIR-II organic small molecule probe for labeling lymph nodes and guiding tumor imaging. Talanta 2024, 266.