BJ5183-AD-1電轉感受態(tài)細胞

產品規(guī)格CAT#: BFNC86044-01(5×50ul)/BFNC86044-02(20×50ul)

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell             50μl/支

pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl):                            10μl

保存條件(保質期)：                                                -80℃（6個月）

基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Str^R) [pAdEasy-1 (Amp^R)]

BJ5183-AD-1電轉感受態(tài)細胞

產品說明

BJ5183-AD-1是攜帶了腺病毒質粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)常用的感受態(tài)細胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細胞較強的重組能力，有利于轉入的目的基因與腺病毒骨架質粒的重組。endA1（缺失核酸內切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株細胞中已經提前轉入了腺病毒質粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，賦予該菌株氨芐抗性，在病毒質粒構建時，只需轉入線性化的目的質粒即可，簡化了實驗步驟，提高了病毒質粒重組概率。Str^R 賦予BJ5183-AD-1菌株鏈霉素抗性。

青旗生物生產的BJ5183-AD-1電擊感受態(tài)細胞適用于普通質粒和大質粒的構建，經特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒(size:1163bp)檢測轉化效率>1×10⁶ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的BJ5183-AD-1電擊感受態(tài)細胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒pCAMBIA2301；

B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

S.O.C 培養(yǎng)基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10。

2. 電轉感受態(tài)細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?；蛳氆@得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

6. 對于連接產物轉化，盡量轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態(tài)細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質?；蜻B接產物可相應減少終用于涂板的菌量。

8. 電轉感受態(tài)細胞盡量保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。